Este protocolo demuestra cómo investigar la secreción celular utilizando imágenes en vivo por microscopía TOF y proporciona herramientas para detectar eventos de agrupación o regiones de alta actividad. Usando este protocolo, podemos generar cultivos celulares en superficies de micropatrón que normalizan la división celular y así facilitar los rangos especiales de eventos secretores. Las células secretan una variedad de macromoléculas que desempeñan un papel importante en la regulación inmune.
En el cáncer, la secreción desregulada afecta la liberación de enzimas proteolíticas que facilitan la invasión. La cuantificación de la secreción nos permitirá comprender mejor la secreción degradada en el cáncer y otros procesos dinámicos como la presentación del antígeno. Aunque nuestro protocolo de diagnóstico por imágenes y análisis es sencillo, requiere la generación de células únicas que estén bien extendidas en una pieza de micropatrón.
En este video, demostraremos cómo cultivar células en portadas de micropatrón y cómo visualizar y analizar eventos secretores utilizando herramientas estadísticas espaciales. Para preparar cubreobjetos para micropatrón, active los cubreobjetos de vidrio esterilizados con etanol de 25 milímetros de diámetro bajo luz ultravioleta profunda durante cinco minutos. Mientras se activan los cubreobjetos, agregue una gota de 30 microlitro de polietilenglicol por injerto de polilitros en un trozo de película de parafina dentro de una cámara húmeda.
Al final de la activación, coloque los cubreobjetos activados en el lado de la superficie hacia abajo sobre las gotas y cubra la cámara húmeda durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los cubreobjetos dos veces en agua destilada. Mientras los cubreobjetos se secan, lave una máscara fotográfica de cuarzo una vez con agua destilada y una vez con alcohol.
Seque la máscara fotográfica con flujo de aire filtrado y exponga el lado cromado de la máscara fotográfica recubierto de lado a la luz ultravioleta profunda durante cinco minutos. Al final de la iluminación, agregue una gota de 10 microlitro de agua en el lado cromado de cada máscara de foto y coloque el lado de polietilenglicol de cada cubrelobjetos en cada gota de agua. Después de eliminar el exceso de agua, coloque una cubierta de película sobre los portaobjetos para evitar la deshidratación.
Exponga los lados recubiertos no cromados de las máscaras fotográficas a la luz ultravioleta profunda durante cinco minutos adicionales antes de añadir exceso de agua a las máscaras fotográficas para eliminar los cubreobjetos. Este paso producirá las impresiones de micropatrón en la superficie. A continuación, incubar los cubreobjetos en una solución de proteína de matriz extracelular en película de parafina en una cámara húmeda durante una hora bajo una campana de flujo laminar.
Para la siembra celular sobre la superficie de micropatrón preparada, al final de la incubación, coloque los cubreobjetos en un soporte de tapa magnética de micropatrón hacia arriba y agregue inmediatamente un medio de patrón a los cubreobjetos. Después de añadir el sello, inmovilice los cubreobjetos con el dispositivo magnético antes de llenar el soporte de cubreobjetos con un medio de patrón adicional. A continuación, cierre el soporte con una tapa de vidrio.
Cuando las células estén listas, agregue 5 veces 10 a la 5a de las células epiteliales de pigmento de retina inmortalizados trans infectadas a los cubreobjetos e incubar las células en el soporte durante 10 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, utilice una pipeta para aspirar el medio viejo mientras utiliza una segunda pipeta para lavar las células cinco veces con medio fresco por lavado para eliminar las células no unidas y cualquier suero bovino fetal residual. Después del último lavado, devuelva el soporte a la incubadora durante tres horas para permitir la propagación de la célula completa.
Para tomar imágenes de eventos de exocitosis, coloque el soporte de cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total y busque una célula que exprese VAMP7-pHluorin que esté completamente extendida. Cambie el ángulo del láser hasta que se alcance un ángulo de fluorescencia de reflexión interna total que permita la visualización de eventos de exocitosis VAMP7-pHluorin y realice una adquisición de cinco minutos a una frecuencia compatible con la velocidad de exocitosis y la escala de tiempo. Para obtener las coordenadas de la exocitosis, abra la película de eventos de exocitosa adquirida en Fiji e identifique manualmente los eventos de exocitosis por la aparición de una señal brillante que se extiende hacia el exterior.
Utilice la herramienta de punto para marcar el centro del evento de exocitosis y utilice analizar y medir para medir las coordenadas x e y, así como la coordenada temporal. Guarde las medidas de una celda en un archivo de texto. Abra el archivo de texto en una hoja de cálculo y elimine todas las columnas de coordenadas x e y excepto las del sector.
A continuación, utilice la herramienta ovalada y mida para medir el centro y el diámetro y para obtener las coordenadas x e y y el diámetro de Feret de cada celda. Guarde las medidas de todas las celdas en un archivo de texto. Abra el archivo de texto en una hoja de cálculo y elimine todas las columnas de coordenadas x e y y de Feret.
Luego agregue la medición de radio para cada celda, luego obtenga el radio del diámetro del Feret para cada celda. Utilice la herramienta de línea recta para medir el grosor del anillo de micropatrón de cada celda. Guarde esta medición para todas las celdas en un archivo de texto y, a continuación, divida la longitud de adhesión por el radio de celda para calcular la longitud de adhesión normalizada.
Para el análisis espacial de una sola celda, instale primero el paquete de RStudio y cargue el paquete en RStudio. Ejecute el paquete con la función ESA. Se abrirá una interfaz de usuario y, a continuación, seleccione el directorio de los archivos TXT del conjunto de datos y un directorio para los trazados de salida.
El script se iniciará y realizará automáticamente el análisis, proporcionando archivos PDF de las gráficas correspondientes y archivos TXT que contienen los resultados numéricos. Dentro de la célula, el suelo en la sonda es sofocado por el bajo pH del lisosoma, pero durante la exocitosis, la pHluorin comienza a emitir una señal a medida que el pH aumenta debido a la liberación de protones. La señal de pHluorin exhibe un pico durante la exocitosis que representa la liberación rápida de protones lisosomales, seguido de una descomposición de la señal exponencial que representa la difusión 2D de la sonda en la membrana plasmática.
Típicamente, las células epiteliales pigmentadas de retina humanas transfectizadas demuestran una actividad importante de secreción lisosomal con una tasa media de exocitosis de 0,28 Hercios. Es posible visualizar la distribución 2D de la exocitosis por estimación de densidad del núcleo para revelar diferencias en las densidades locales. Hay tres posibles desviaciones de la aleatoriedad espacial completa: agrupación en clústeres, dispersión o una mezcla de agrupamiento y dispersión.
La función K de Ripley se puede utilizar para evaluar estas desviaciones. Cabe destacar que los eventos de exocitosis en el área no adhesiva también se agrupan indicando que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que inducen puntos críticos secretores en las membranas plasmáticas. Trazar el histograma de eventos de exocitosis de acuerdo con el módulo de una célula representativa revela un pico alrededor del borde entre las áreas adhesivas y no adhesivas.
El análisis emparejado demuestra que la densidad de la superficie es menor en el área de adhesión que en el área de no adhesión, potencialmente debido a la fuerte disminución de la exocitosis en la periferia celular. La combinación de la adhesión celular en micropatrón con el análisis estadístico facilita la capacidad de identificar cómo se regulan en el espacio los procesos celulares complejos, como la secreción. Se necesita más trabajo futuro para determinar qué mecanismo molecular subyacen a la agrupación de la actividad secretora.
