Ce protocole montre comment étudier la sécrétion cellulaire à l’aide de l’imagerie en direct par microscopie TOF et fournit des outils pour détecter les événements de clustering ou les régions à forte activité. En utilisant ce protocole, nous pouvons générer des cultures cellulaires sur des surfaces micropatrées qui normalisent la division cellulaire et facilitent ainsi les gammes spéciales d’événements sécrétaires. Les cellules sécrètent une variété de macromolécules qui jouent un rôle important dans la régulation immunitaire.
Dans le cancer, la sécrétion déréglementée affecte la libération d’enzymes protéolytiques qui facilitent l’invasion. La quantification de la sécrétion nous permettra de mieux comprendre la sécrétion dégradée dans le cancer et d’autres processus dynamiques tels que la présentation des antigènes. Bien que notre protocole d’imagerie et d’analyse soit simple, il nécessite la génération de cellules individuelles qui sont bien réparties sur un morceau de micropatrin.
Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment la culture des cellules sur les coverslips micropattern et comment visualiser et analyser les événements sécrétaires à l’aide d’outils statistiques spacial. Pour préparer des coverslips pour le micropatterning, activez des couvertures en verre stérilisées à l’éthanol de 25 millimètres de diamètre sous une lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes. Pendant que les coverslips sont activés, ajoutez une goutte de 30 microlitres de polyéthylène glycol de greffe de polyéthylène par coverslip sur un morceau de film de paraffine dans une chambre humide.
À la fin de l’activation, placez les coverslips activés côté surface vers le bas sur les gouttes et couvrir la chambre humide pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les couvercles deux fois dans de l’eau distillée. Pendant que les coverslips sèchent, lavez un masque photo en quartz une fois avec de l’eau distillée et une fois avec de l’alcool.
Séchez le masque photo avec un flux d’air filtré et exposez le côté chromé du masque photo jusqu’à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes. À la fin de l’éclairage, ajouter une goutte d’eau de 10 microlitres sur le côté chromé de chaque masque photo et placer le côté polyéthylène glycol de chaque coverslip sur chaque goutte d’eau. Après avoir enlevé tout excès d’eau, placez un couvercle de film sur les toboggans pour éviter la déshydratation.
Exposez les côtés non chromés des masques photo à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes supplémentaires avant d’ajouter un excès d’eau aux masques photo pour enlever les coverslips. Cette étape produira les empreintes de micropattern sur la surface. Puis incuber les coverslips dans une solution protéique matricielle extracellulaire sur film de paraffine dans une chambre humide pendant une heure sous un capot d’écoulement laminaire.
Pour l’ensemencement cellulaire sur la surface micropatreuse préparée, à la fin de l’incubation, placez les coverslips dans un support magnétique de couverture côté micropattern vers le haut et ajoutez immédiatement le milieu de modèle aux coverslips. Après avoir ajouté le joint, immobiliser les coverslips avec le dispositif magnétique avant de remplir le support de coverslip avec le milieu de motif supplémentaire. Ensuite, fermez le support avec un couvercle en verre.
Lorsque les cellules sont prêtes, ajouter 5 fois 10 à la 5ème des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées transfectées aux coverslips et incuber les cellules dans le support pendant 10 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette pour aspirer l’ancien milieu tout en utilisant une deuxième pipette pour laver les cellules cinq fois avec un milieu frais par lavage pour enlever les cellules non attachées et tout sérum bovin fœtal résiduel. Après le dernier lavage, remettre le support à l’incubateur pendant trois heures pour permettre la propagation complète des cellules.
Pour les événements d’exocytose d’image, placez le support de coverslip sous un microscope interne total de fluorescence de réflexion, et recherchez une cellule exprimant VAMP7-pHluorin qui est entièrement écartée. Modifiez l’angle du laser jusqu’à ce qu’un angle de fluorescence de réflexion interne total qui permette la visualisation des événements d’exocytose vamp7-pHluorin soit atteint et effectuez une acquisition de cinq minutes à une fréquence compatible avec le taux d’exocytose et l’échelle de temps. Pour obtenir les coordonnées de l’exocytose, ouvrez le film d’événement d’exocytose acquis aux Fidji et identifiez manuellement les événements d’exocytose par l’apparition d’un signal lumineux qui se propage vers l’extérieur.
Utilisez l’outil point pour marquer le centre de l’événement d’exocytose et utilisez l’analyse et la mesure pour mesurer les coordonnées x et y ainsi que la coordonnée temporelle. Enregistrez les mesures d’une cellule dans un fichier texte. Ouvrez le fichier texte dans une feuille de calcul et supprimez toutes les colonnes de la tranche x et de la coordonnée y.
Ensuite, utilisez l’outil ovale et mesurez pour mesurer le centre et le diamètre et pour obtenir les coordonnées x et y et le diamètre de Feret de chaque cellule. Enregistrez les mesures de toutes les cellules dans un seul fichier texte. Ouvrez le fichier texte dans une feuille de calcul et supprimez toutes les colonnes de diamètre, sauf x et y, ainsi que les colonnes de diamètre de Feret.
Ajoutez ensuite la mesure du rayon pour chaque cellule, puis obtenez le rayon du diamètre du Feret pour chaque cellule. Utilisez l’outil en ligne droite pour mesurer l’épaisseur de l’anneau de micropatrin de chaque cellule. Enregistrez cette mesure pour toutes les cellules dans un fichier texte, puis divisez la longueur d’adhérence par le rayon cellulaire pour calculer la longueur normalisée de l’adhérence.
Pour l’analyse spatiale à cellule unique, installez d’abord le paquet de RStudio et chargez le paquet dans RStudio. Exécutez le paquet avec la fonction ESA. Une interface utilisateur s’ouvrira, puis sélectionnera l’annuaire pour les fichiers TXT de l’ensemble de données et un répertoire pour les parcelles de sortie.
Le script démarre et effectue automatiquement l’analyse, fournissant des fichiers PDF des parcelles correspondantes et des fichiers TXT contenant les résultats numériques. À l’intérieur de la cellule, le plancher de la sonde est trempé par le pH bas du lysosome, mais pendant l’exocytose, la pHluorine commence à émettre un signal à mesure que le pH augmente en raison de la libération de protons. Le signal de pHluorin montre un pic pendant l’exocytose qui représente la libération rapide des protons lysosomaux, suivi d’une désintégration exponentielle du signal qui représente la diffusion 2D de la sonde à la membrane plasmatique.
Typiquement, les cellules épithéliales pigmentées rétiniennes immortalisées transfect démontrent une activité importante de sécrétion lysosomale avec un taux moyen d’exocytose de 0,28 Hertz. Il est possible de visualiser la distribution 2D de l’exocytose par estimation de densité de noyau pour révéler des différences dans les densités locales. Il y a trois déviations possibles du hasard spatial complet : clustering, dispersion, ou un mélange de clustering et de dispersion.
La fonction K de Ripley peut être utilisée pour évaluer ces écarts. Il convient de noter que les événements d’exocytose dans la zone non adhésive sont également regroupés indiquant que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui induisent des points chauds sécrétaires aux membranes plasmatiques. Tracer l’histogramme des événements d’exocytose selon le modulus pour une cellule représentative révèle un pic autour de la frontière entre les zones adhésives et non adhésives.
L’analyse appariée démontre que la densité de surface est plus faible dans la zone d’adhérence que dans la zone de non-adhérence, potentiellement due à la forte diminution de l’exocytose à la périphérie cellulaire. La combinaison de l’adhérence cellulaire sur les micropatrins avec l’analyse statistique facilite la capacité de déterminer comment les processus cellulaires complexes tels que la sécrétion sont régulés dans l’espace. D’autres travaux futurs sont nécessaires pour déterminer quel mécanisme moléculaire qui sous-tend le regroupement de l’activité sécrétaire.
