Este protocolo demonstra como investigar a secreção celular usando imagens vivas pela microscopia TOF e fornece ferramentas para detectar eventos de clustering ou regiões de alta atividade. Usando este protocolo, podemos gerar culturas celulares em superfícies de micropattern que normalizam a divisão celular e, assim, facilitam as faixas especiais de eventos secretos. As células secretam uma variedade de macromoléculas que desempenham papéis importantes na regulação imunológica.
No câncer, a secreção desregulamentada afeta a liberação de enzimas proteolíticas que facilitam a invasão. A quantificação da secreção nos permitirá entender melhor a secreção degradada no câncer e outros processos dinâmicos como a apresentação de antígenos. Embora nosso protocolo de imagem e análise seja simples, requer a geração de células únicas que estão bem espalhadas em um pedaço de micropattern.
Neste vídeo, vamos demonstrar como cultivar células em capas de micropattern e como visualizar e analisar eventos secretos usando ferramentas estatísticas espaciais. Para preparar tampas para micropatterning, ative o etanol esterilizado de 25 milímetros de diâmetro de tampas de vidro sob luz ultravioleta profunda por cinco minutos. Enquanto as tampas estão sendo ativadas, adicione uma gota de 30 microliteres de polietileno glicol por deslizamento de cobertura em um pedaço de filme de parafina dentro de uma câmara úmida.
No final da ativação, coloque as manchas ativadas lado da superfície para baixo sobre as gotas e cubra a câmara úmida para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as tampas duas vezes em água destilada. Enquanto as tampas estão secando, lave uma máscara de quartzo uma vez com água destilada e uma vez com álcool.
Seque a máscara fotográfica com fluxo de ar filtrado e exponha o lado cromado cromado da máscara fotográfica até a luz ultravioleta profunda por cinco minutos. No final da iluminação, adicione uma gota de 10 microliter de água no lado cromado revestido de cada máscara fotográfica e coloque o lado de polietileno glicol de cada mancha em cada gota de água. Depois de remover qualquer excesso de água, coloque uma tampa de filme sobre os slides para evitar a desidratação.
Exponha as laterais revestidas não cromadas das máscaras fotográficas à luz ultravioleta profunda por mais cinco minutos antes de adicionar água em excesso às máscaras fotográficas para remover os clipes de cobertura. Esta etapa produzirá as impressões de micropattern na superfície. Em seguida, incubar as tampas em uma solução de proteína de matriz extracelular em filme de parafina em uma câmara úmida por uma hora sob um capô de fluxo laminar.
Para a semeadura celular na superfície de micropattern preparada, no final da incubação, coloque as tampas em um lado micropattern portador de tampa magnética para cima e adicione imediatamente o meio padrão às tampas. Depois de adicionar o selo, imobilize as tampas com o dispositivo magnético antes de encher o suporte de deslizamento de tampas com meio de padrão adicional. Em seguida, feche o suporte com uma tampa de vidro.
Quando as células estiverem prontas, adicione 5 vezes 10 ao 5º do pigmento de retina imortalizado transfectado células epiteliais aos deslizamentos e incubar as células no suporte por 10 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, use uma pipeta para aspirar o meio antigo enquanto usa uma segunda pipeta para lavar as células cinco vezes com meio fresco por lavagem para remover as células não anexadas e qualquer soro bovino fetal residual. Após a última lavagem, devolva o suporte à incubadora por três horas para permitir a propagação completa da célula.
Para os eventos de exocistose de imagem, coloque o titular do deslizamento de tampas sob um microscópio de fluorescência de reflexão interna total e procure por uma célula expressando VAMP7-pHluorin que está totalmente espalhada. Altere o ângulo do laser até que um ângulo total de fluorescência de reflexão interna que permita a visualização de eventos de exocitose VAMP7-pHluorin seja alcançado e realize uma aquisição de cinco minutos em uma frequência compatível com a taxa de exocitose e escala de tempo. Para obter as coordenadas da exocitose, abra o filme de evento de exocitose adquirido em Fiji e identifique manualmente os eventos de exocitose pelo aparecimento de um sinal brilhante que se espalha para fora.
Use a ferramenta de ponto para marcar o centro do evento de exocistose e use análise e medida para medir as coordenadas x e y, bem como a coordenada temporal. Salve as medidas de uma célula em um arquivo de texto. Abra o arquivo de texto em uma planilha e remova todas, exceto as colunas fatia x e y-coordinate.
Em seguida, use a ferramenta oval e meça para medir o centro e o diâmetro e para obter as coordenadas x e y e o diâmetro de Feret de cada célula. Salve as medidas de todas as células em um arquivo de texto. Abra o arquivo de texto em uma planilha e remova todas, exceto as colunas x e y-coordinate e feret de diâmetro.
Em seguida, adicione a medição do raio para cada célula e, em seguida, obtenha o raio do diâmetro do Feret para cada célula. Use a ferramenta de linha reta para medir a espessura do anel de micropattern de cada célula. Guarde esta medição para todas as células em um arquivo de texto e, em seguida, divida o comprimento de adesão pelo raio celular para calcular o comprimento de adesão normalizado.
Para análise espacial de célula única, instale primeiro o pacote de RStudio e carregue o pacote no RStudio. Execute o pacote com a função ESA. Uma interface de usuário será aberta e, em seguida, selecionará o diretório para os arquivos TXT de conjunto de dados e um diretório para os gráficos de saída.
O script iniciará e executará automaticamente a análise, fornecendo arquivos PDF das parcelas correspondentes e arquivos TXT contendo os resultados numéricos. Dentro da célula, o piso da sonda é saciado pelo pH baixo do lysosome, mas durante a exocitose, a pHLuorin começa a emitir um sinal à medida que o pH aumenta devido à liberação de prótons. O sinal de phluorina exibe um pico durante a exocitese que representa a liberação rápida de prótons liossômicos, seguido por uma decadência exponencial de sinal que representa a difusão 2D da sonda na membrana plasmática.
Tipicamente, as células epiteliais pigmentadas da retina humana imortalizadas demonstram uma importante atividade de secreção liossômica com uma taxa média de excitose de 0,28 Hertz. É possível visualizar a distribuição 2D da exocitose pela estimativa de densidade do kernel para revelar diferenças nas densidades locais. Existem três possíveis desvios da aleatoriedade espacial completa: agrupamento, dispersão ou uma mistura de agrupamento e dispersão.
A função K de Ripley pode ser usada para avaliar esses desvios. Note-se que os eventos de exocitose na área não adesiva também são agrupados indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que induzem pontos de acesso secretos em membranas plasmáticas. Traçar o histograma dos eventos de exocitose de acordo com o módulo para uma célula representativa revela um pico ao redor da fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.
A análise emparelhada demonstra que a densidade da superfície é menor na área de adesão do que na área de não adesão, potencialmente devido à forte diminuição da exoctose na periferia celular. A combinação da adesão celular em micropatters com análise estatística facilita a capacidade de identificar como processos celulares complexos, como a secreção, são regulados no espaço. Mais trabalhos futuros são necessários para determinar qual mecanismo molecular que está por trás do agrupamento da atividade secreta.
