Dieses Protokoll veranschaulicht, wie die Zellsekretion mithilfe der Live-Bildgebung durch die TOF-Mikroskopie untersucht wird, und stellt Tools zum Erkennen von Clustering-Ereignissen oder Regionen mit hoher Aktivität bereit. Mit diesem Protokoll können wir Zellkulturen auf Mikromusteroberflächen erzeugen, die die Zellteilung normalisieren und so die speziellen Bereiche von Sekretorischen Ereignissen erleichtern. Zellen sezernieren eine Vielzahl von Makromolekülen, die eine wichtige Rolle bei der Immunregulation spielen.
Bei Krebs wirkt sich die deregulierte Sekretion auf die Freisetzung proteolytischer Enzyme aus, die die Invasion erleichtern. Die Quantifizierung der Sekretion wird es uns ermöglichen, die degradierte Sekretion bei Krebs und anderen dynamischen Prozessen wie Antigendarstellung besser zu verstehen. Obwohl unser Bildgebungs- und Analyseprotokoll einfach ist, erfordert es die Erzeugung einzelner Zellen, die gut auf einem Stück Mikromuster verteilt sind.
In diesem Video zeigen wir, wie Zellen auf Mikromuster-Coverlips kulturiert werden und wie sekretore Ereignisse mithilfe von räumlichen statistischen Werkzeugen visualisiert und analysiert werden. Um Abdeckungen für die Mikromusterung vorzubereiten, aktivieren Sie für fünf Minuten ethanolsterilisierte Glasabdeckungen mit einem Durchmesser von 25 Millimetern unter tiefem ultraviolettem Licht. Während die Abdeckungen aktiviert werden, fügen Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen Polylysin-Transplantat Polyethylenglykol pro Deckelrutsch auf ein Stück Paraffinfolie in einer feuchten Kammer hinzu.
Am Ende der Aktivierung die betätigte Decklippenseite auf die Tropfen legen und die feuchte Kammer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur bedecken. Am Ende der Inkubation die Deckel zweimal in destilliertem Wasser waschen. Während die Abdeckungen trocknen, waschen Sie einmal eine Quarz-Fotomaske mit destilliertem Wasser und einmal mit Alkohol.
Trocknen Sie die Fotomaske mit gefiltertem Luftstrom und setzen Sie die Fotomaske verchromte Seite für fünf Minuten bis zu tiefem ultraviolettem Licht aus. Am Ende der Beleuchtung einen 10-Mikroliter-Tropfen Wasser auf die verchromte Seite jeder Fotomaske geben und die Polyethylenglykolseite jedes Deckelrutsches auf jeden Tropfen Wasser legen. Nachdem Sie überschüssiges Wasser entfernt haben, legen Sie eine Filmabdeckung über die Dias, um Eine Austrocknung zu vermeiden.
Setzen Sie die nicht verchromten Seiten der Fotomasken weitere fünf Minuten tief ultraviolettem Licht aus, bevor Sie den Fotomasken überschüssiges Wasser hinzufügen, um die Abdeckungen zu entfernen. Dieser Schritt erzeugt die Mikromusterabdrücke auf der Oberfläche. Dann die Coverlips in einer extrazellulären Matrixproteinlösung auf Paraffinfolie in einer feuchten Kammer für eine Stunde unter einer laminaren Strömungshaube inkubieren.
Für die Zellaussaat auf der vorbereiteten Mikromusteroberfläche legen Sie am Ende der Inkubation die Abdeckungen in eine magnetische Deckblatthalter-Mikromusterseite nach oben und fügen Sie den Abdeckungen sofort mustermedium hinzu. Nach dem Hinzufügen der Dichtung die Abdeckungen mit dem Magnetgerät immobilisieren, bevor Sie den Deckelhalter mit zusätzlichem Mustermedium befüllen. Schließen Sie dann den Halter mit einem Glasdeckel.
Wenn die Zellen bereit sind, fügen Sie 5 mal 10 zum 5. der transfizierten verewigten retinalen Pigmentepithelzellen zu den Abdeckungen hinzu und inkubieren Sie die Zellen im Halter für 10 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Pipette, um das alte Medium zu aspirieren, während Sie eine zweite Pipette verwenden, um die Zellen fünfmal mit frischem Medium pro Waschmittel zu waschen, um die nicht angeschlossenen Zellen und alle verbleibenden fetalen Rinderserum zu entfernen. Nach der letzten Wäsche, geben Sie den Halter für drei Stunden zum Inkubator zurück, um eine vollständige Zellausbreitung zu ermöglichen.
Um Exozytose-Ereignisse abzubilden, platzieren Sie den Deckelschlupfhalter unter ein gesamtes internes Reflexionsfluoreszenzmikroskop und suchen Sie nach einer Zelle, die VAMP7-pHluorin exzessiiert, die vollständig verbreitet ist. Ändern Sie den Winkel des Lasers, bis ein gesamtinterner Reflexionsfluoreszenzwinkel erreicht ist, der die Visualisierung von VAMP7-pHluorin-Exozytose-Ereignissen ermöglicht, und führen Sie eine fünfminütige Erfassung bei einer Frequenz durch, die mit der Exozytoserate und der Zeitskala kompatibel ist. Um die Exozytose-Koordinaten zu erhalten, öffnen Sie den erworbenen Exozytose-Ereignisfilm auf Fidschi und identifizieren Sie die Exozytose-Ereignisse manuell durch das Auftreten eines hellen Signals, das sich nach außen ausbreitet.
Verwenden Sie das Punktwerkzeug, um den Mittelpunkt des Exozytoseereignisses zu markieren, und verwenden Sie Analysieren und Messen, um die x- und y-Koordinaten sowie die zeitliche Koordinate zu messen. Speichern Sie die Messungen einer Zelle in einer Textdatei. Öffnen Sie die Textdatei in einer Kalkulationstabelle, und entfernen Sie alle Spalten mit der Zeit bis auf die Segmente x und y-Koordinaten.
Verwenden Sie als Nächstes das ovale Werkzeug und messen Sie, um den Mittelpunkt und den Durchmesser zu messen und die x- und y-Koordinaten und den Feret-Durchmesser jeder Zelle zu erhalten. Speichern Sie die Messungen aller Zellen in einer Textdatei. Öffnen Sie die Textdatei in einer Kalkulationstabelle, und entfernen Sie alle Spalten außer der x- und y-Koordinate sowie der Durchmesservon Feret.
Fügen Sie dann die Radiusmessung für jede Zelle hinzu, und erhalten Sie dann den Radius aus dem Feret-Durchmesser für jede Zelle. Verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug, um die Dicke des Mikromusterrings jeder Zelle zu messen. Speichern Sie diese Messung für alle Zellen in einer Textdatei, und teilen Sie dann die Haftlänge durch den Zellradius, um die normalisierte Haftlänge zu berechnen.
Installieren Sie für die räumliche Einzelzellanalyse zuerst das Paket von RStudio, und laden Sie es in RStudio. Führen Sie das Paket mit der ESA-Funktion aus. Eine Benutzeroberfläche wird geöffnet und dann das Verzeichnis für die Dataset-TXT-Dateien und ein Verzeichnis für die Ausgabediagramme ausgewählt.
Das Skript startet und führt die Analyse automatisch durch und stellt PDF-Dateien der entsprechenden Plots und TXT-Dateien mit den numerischen Ergebnissen bereit. Im Inneren der Zelle wird der Boden in der Sonde durch den niedrigen pH-Wert des Lysosoms abgeschreckt, aber während der Exozytose beginnt pHluorin ein Signal auszusenden, wenn der pH-Wert aufgrund der Protonenfreisetzung zunimmt. Das pHluorin-Signal weist während der Exozytose einen Höhepunkt auf, der die schnelle Freisetzung von lysosomalen Protonen darstellt, gefolgt von einem exponentiellen Signalzerfall, der die 2D-Diffusion der Sonde an der Plasmamembran darstellt.
Typischerweise zeigen transfezierte verewigte menschliche retinale pigmentierte Epithelzellen eine wichtige lysosomale Sekretionsaktivität mit einer durchschnittlichen Exozytoserate von 0,28 Hertz. Es ist möglich, die 2D-Verteilung der Exozytose durch Kerneldichteschätzung zu visualisieren, um Unterschiede in der lokalen Dichte aufzudecken. Es gibt drei mögliche Abweichungen von der vollständigen räumlichen Zufälligkeit: Clustering, Dispersion oder eine Mischung aus Clustering und Dispersion.
Ripleys K-Funktion kann verwendet werden, um diese Abweichungen zu bewerten. Bemerkenswert ist, dass Exozytose-Ereignisse im nicht-klebenden Bereich ebenfalls gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hotspots an Plasmamembranen induzieren. Das Aufzeichnen des Histogramms von Exozytoseereignissen nach dem Modul für eine repräsentative Zelle zeigt einen Höhepunkt um die Grenze zwischen den klebenden und nicht klebenden Bereichen.
Die gepaarte Analyse zeigt, dass die Oberflächendichte im Haftbereich geringer ist als im Nicht-Haftbereich, was möglicherweise auf die starke Abnahme der Exozytose an der Zellperipherie zurückzuführen ist. Die Kombination von Zellhaftung auf Mikromustern mit statistischen Analysen erleichtert die Möglichkeit, zu bestimmen, wie komplexe zelluläre Prozesse wie Sekretion im Raum reguliert werden. Es bedarf weiterer zukünftiger Arbeiten, um zu bestimmen, welcher molekulare Mechanismus der Clusterbildung geheimer Aktivität zugrunde liegt.
