이 프로토콜은 TOF 현미경검사법에 의한 라이브 이미징을 사용하여 세포 분비를 조사하는 방법을 보여 주며 군집 이벤트 또는 높은 활성 영역을 검출하는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 세포 분열을 정상화하고 따라서 분비 이벤트의 특별한 범위를 용이하게 마이크로 패턴 표면에 세포 배양을 생성 할 수 있습니다. 세포는 면역 조절에서 중요한 역할을 하는 다양한 거대 분자를 분비합니다.
암에서, 규제 된 분비 침략을 촉진 하는 단백질 분해 효소의 방출에 영향을 미칩니다. 분비의 정량화는 우리가 암및 항원 프리젠 테이션이 있는 그밖 동적 프로세스에 있는 저하된 분비를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 우리의 화상 진찰 및 분석 프로토콜은 간단하더라도, 마이크로 패턴의 조각에 잘 퍼지는 단 하나 세포의 생성을 요구합니다.
이 비디오에서는 마이크로패턴 커버립에서 세포를 배양하는 방법과 간격 통계 도구를 사용하여 비밀 이벤트를 시각화하고 분석하는 방법을 시연합니다. 마이크로패터닝을 위해 커버립을 준비하려면 에탄올을 살균하여 25mm 직경의 유리 커버립을 깊은 자외선 아래에서 5분간 활성화하십시오. 커버립이 활성화되는 동안 커버슬립당 폴리에틸렌 글리콜30 마이크로리터 드롭을 습한 챔버 내파라핀 필름에 넣습니다.
활성화가 끝나면 커버립활성화 표면면을 낙하에 내려놓고 습한 챔버를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 커버립을 증류수로 두 번 씻으실 수 있습니다. 커버립이 건조되는 동안 석영 포토 마스크를 증류수로 한 번, 술로 한 번 씻으십시오.
여과 된 공기 흐름으로 포토 마스크를 건조하고 5 분 동안 깊은 자외선에 깊은 자외선에 크롬 코팅 사진 마스크 크롬을 노출. 조명의 끝에서, 각 사진 마스크의 크롬 코팅 측에 물 10 마이크로 리터 드롭을 추가하고 각 커버 슬립의 폴리에틸렌 글리콜 측면을 물 방울에 배치합니다. 여분의 물을 제거 한 후, 탈수를 방지하기 위해 슬라이드 위에 필름 커버를 배치합니다.
사진 마스크의 비크롬 코팅 측면을 깊은 자외선에 노출시키고 5분 간 추가로 포토 마스크에 여분의 물을 추가하여 커버립을 제거합니다. 이 단계는 표면에 마이크로 패턴 인쇄물을 생성합니다. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에서 1시간 동안 습한 챔버에서 파라핀 필름에 세포외 매트릭스 단백질 용액으로 커버립을 배양한다.
준비된 마이크로패턴 표면에 셀 파종의 경우, 인큐베이션의 끝에 커버립을 자기 커버슬립 홀더 마이크로패턴 측에 넣고 즉시 패턴 매체를 커버립에 추가합니다. 씰을 추가한 후 커버슬립 홀더를 추가 패턴 매체로 채우기 전에 자기 장치로 커버립을 고정합니다. 그런 다음 유리 뚜껑으로 홀더를 닫습니다.
세포가 준비되면, 감염된 불멸의 망막 색소 상피 세포의 5분의 5에 5회 10번을 추가하고 세포 배양인에서 10분 동안 홀더내의 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 두 번째 파이펫을 사용하여 세척당 신선한 배지로 세포를 5회 세척하는 동안 오래된 배지를 흡인하기 위해 파이펫 을 사용하여 부착되지 않은 세포와 잔류 태아 소 혈청을 제거하십시오. 마지막 세척 후, 전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 홀더를 반환합니다.
외세포증 이벤트를 이미지하기 위해, 커버슬립 홀더를 총 내부 반사 형광 현미경 아래에 놓고 완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 세포를 검색한다. VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경하고 외세포 속도 및 시간대와 호환되는 주파수에서 5분 간의 수집을 수행한다. 외세포증 좌표를 얻으려면 피지에서 획득된 엑소시토시스 이벤트 영화를 열고 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 모양으로 엑소시토시스 이벤트를 수동으로 식별합니다.
포인트 도구를 사용하여 외세포증 이벤트의 중심을 표시하고 분석 및 측정을 사용하여 x 및 y 좌표뿐만 아니라 측두측 좌표를 측정합니다. 한 텍스트 파일에 한 셀의 측정값을 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 슬라이스 x 및 y 좌표 열을 제외한 모든 부분을 제거합니다.
다음으로 타원형 도구를 사용하여 측정하여 중심과 직경을 측정하고 각 셀의 x 및 y 좌표 및 Feret의 직경을 얻습니다. 모든 셀의 측정값을 한 텍스트 파일에 저장합니다. 스프레드시트에서 텍스트 파일을 열고 x 및 y 좌표 및 Feret의 지름 열을 제외한 모든 것을 제거합니다.
그런 다음 각 셀에 대한 반지름 측정을 추가한 다음 각 셀에 대한 Feret 직경에서 반경을 가져옵니다. 직선 도구를 사용하여 각 셀의 마이크로패턴 링의 두께를 측정합니다. 한 텍스트 파일의 모든 셀에 대해 이 측정값을 저장한 다음 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다.
단일 셀 공간 분석을 위해 먼저 RStudio 패키지를 설치하고 RStudio에 패키지를 로드합니다. ESA 함수로 패키지를 실행합니다. 사용자 인터페이스가 열리고 데이터 집합 TXT 파일의 디렉터리와 출력 플롯에 대한 디렉토리를 선택합니다.
스크립트는 자동으로 분석을 시작하고 수행하여 해당 플롯및 숫자 결과가 포함된 TXT 파일의 PDF 파일을 제공합니다. 세포 내부, 프로브의 바닥은 리소좀의 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 외세포증 동안, pHluorin은 양성자 방출로 인해 pH가 증가함에 따라 신호를 방출하기 시작한다. pHluorin 신호는 리소소말 양성자의 빠른 방출을 나타내는 외세포증 동안 피크를 나타내고, 플라즈마 멤브레인에서 프로브의 2D 확산을 나타내는 지수 신호 붕괴가 뒤따릅니다.
전형적으로, 임신 불멸의 인간 망막 색소 상피 세포는 0.28 Hertz의 평균 외세포율을 가진 중요한 리소말 분비 활성을 보여줍니다. 커널 밀도 추정에 의해 외세포증의 2D 분포를 시각화하여 로컬 밀도의 차이를 나타낼 수 있다. 클러스터링, 분산 또는 클러스터링 및 분산의 혼합물과 같은 완전한 공간 임의성에서 세 가지 가능한 편차가 있습니다.
리플리의 K 함수를 사용하여 이러한 편차를 평가할 수 있습니다. 참고로, 비접착영역에서의 외세포증 이벤트는 또한 접착 분자가 혈장 막에서 분비 핫스팟을 유도하는 유일한 구조가 아니라는 것을 나타내는 클러스터링된다. 대표적인 셀에 대한 계수에 따라 외세포증 사건의 히스토그램을 플로팅하면 접착제와 비 접착 영역 사이의 경계 주변의 피크가 드러난다.
쌍분석결과, 비유착 영역보다 접착 영역에서 표면 밀도가 낮으며, 잠재적으로 세포 주변의 외세포증의 강한 감소로 인한 것으로 나타났습니다. 마이크로패턴에 대한 세포 접착력과 통계 분석을 결합하면 분비와 같은 복잡한 세포 프로세스가 공간에서 어떻게 조절되는지 파악할 수 있습니다. 분비 활동의 클러스터링의 기초가 되는 분자 메커니즘을 결정하기 위해서는 더 많은 미래의 작업이 필요합니다.
