该协议允许一致地创建任何形状的高保真蛋白质微图案，特别是用于研究细胞簇的孤立图案孤岛。该技术可用于仅用一个步骤制作任何形状和大小的孤立岛屿微图案，而以前制作此类图案需要两个单独的步骤。首先按照制造商的说明以正确的固化剂与碱基比例混合PDMS。
在室温和压力下孵育15分钟，然后在真空下对混合物进行脱气15分钟。将PDMS倒入主模具中，并将其转移到设置为37摄氏度的培养箱中以固化过夜。从培养箱中取出母模，使其冷却至室温。
当主模具冷却时，在乙醇中超声处理25毫米盖玻片10分钟。使用与正在准备的邮票数量一样多的盖玻片。用去离子水彻底冲洗盖玻片，然后用过滤气枪将其干燥。
在高真空下使用等离子体清洁器用等离子体处理盖玻片一分钟。处理后慢慢释放真空，以防止盖玻片在腔室内移动。在没有阳光直射或头顶照明的房间内，用100微升荧光标记的蛋白质溶液涂覆每个盖玻片。
盖上样品以提供额外的避光保护，并在室温下孵育20分钟。用去离子水彻底冲洗每个盖玻片。将每个盖玻片的侧面轻轻敲击到纸巾或类似的吸水材料上，以清除表面多余的水分。
让盖玻片完全干燥，让它们在黑暗中至少30分钟。当蛋白质涂层盖玻片干燥时，用手术刀或任何锋利的刀片切割，从主模具中取出PDMS印章。在高真空下用等离子体处理 PDMS 印章两分钟。
将邮票放在通风橱下盖有盖子的容器中，然后在每个邮票上涂上一层薄薄的10%3-APTMS，用100%乙醇稀释。用印章盖住容器，并在室温下孵育五分钟。用去离子水彻底冲洗两面的每个印章。
将印章放在干净的容器中，并用去离子水中制备的2.5%戊二醛涂覆它们。盖上印章，在室温下孵育30分钟。用去离子水彻底冲洗印章。
如前所述，从表面上去除多余的水分，让邮票在未覆盖的情况下干燥30分钟。如果30分钟后蛋白质涂层的盖玻片或印章没有完全干燥，请使用过滤气枪将其完全干燥。将印章的图案面推到盖玻片上，并施加足够的压力，使其完全接触。
保持 15 分钟不受干扰。然后小心地从盖玻片上剥离PDMS印章。使用带有适当滤光片的荧光显微镜，检查图案盖玻片的保真度。
立即使用带图案的盖玻片，或将其存放在远离直射光的地方，直至进一步使用。在制备PAA水凝胶前驱体之前，从冰箱中除去丙烯酸NHS酯以达到室温，然后再打开。用70%乙醇灭菌，准备可互换的盖玻片皿，然后在生物安全柜中在紫外线下孵育至少30分钟。
在通风橱下，将1.25毫升在去离子水中制备的40%丙烯酰胺加入15毫升锥形管中。在同一管中，加入175微升在去离子水中制备的双丙烯酰胺溶液。然后加入500微升10X PBS，然后加入2.915毫升去离子水。
将969微升该前体移液到1.5毫升微量离心管中，并将其余部分在四摄氏度下储存长达两周。在新鲜的微量离心管中测量50至100毫克的APS，并将其稀释至去离子水中每毫升100毫克。打开罩中的NHS酯，并在微量离心管中仔细测量高达三毫克的NHS。
将NHS酯稀释至1X PBS中每毫升1毫克。在通风橱下，将两微升TEMED加入含有969微升PAA前体等分试样的微量离心管中。加入15微升一摩尔盐酸盐以降低水凝胶溶液的pH值并避免NHS酯的水解。
向管中加入10微升NHS酯溶液。在生物安全柜中执行以下步骤。小心地将30毫米盖玻片放在盖玻片盘组的中间部分，3-APTMS和戊二醛处理过的一面朝上，并将塑料环拧在上面。
以最小的光照设置图案盖玻片，为下一步做好准备。将五微升APS溶液移液到PAA前体等分试样管中，然后倒置并混合。立即将35微升的溶液移液到30毫米盖玻片上。
将图案化的盖玻片放在溶液上，蛋白质一面朝下。注意不要在水凝胶中产生气泡。保护水凝胶免受光照，并使其聚合90分钟。
一旦水凝胶聚合，使用剃须刀片或手术刀去除上盖玻片，确保盖玻片在取出后不会回落或滑落凝胶，以避免破坏凝胶表面的图案。为了钝化水凝胶中任何剩余的NHS酯，向凝胶中加入两毫升无菌PBS，并在37摄氏度下孵育45分钟。立即准备凝胶进行实验，或将其储存在四摄氏度的无菌PBS中过夜，直到进一步使用。
用水凝胶用荧光纤连蛋白间接图案化，以可视化和测量簇内的细胞牵引力，并创建预定大小和形状的岛状图案。图案质量与铸造PDMS印章的主模的保真度直接相关。该方法可以制造出预定形状的孤立的，定义明确的岛屿图案。
纤连蛋白粘附点仅存在于该岛的所需区域内。这些孤立的粘合点岛进一步允许更好地控制簇状。用两个小的3-APTMS涂覆PDMS邮票至关重要，因为它会限制去除方法的有效性，而太多则会在邮票表面上产生橙色残留物。
这里创建的模式可用于确定单个细胞和簇中的细胞牵引力，从而深入了解它们维持机械稳态的能力。
