牛卵巢皮质组织培养

该协议允许对卵巢微环境进行体外深入检查。使用户能够确定卵泡的生长和发育，以及类固醇生成和免疫分子的丰度。这种技术的一个优点是能够直接评估卵巢微环境和新出现的卵泡的变化，并评估由添加特定激素引起的独特相互作用。

该技术可用于研究导致卵泡停滞的各种生殖障碍。例如，多囊卵巢综合征。由于我们可以在体外直接评估卵巢微环境，因此我实验室的本科生研究员Brooke Bell将演示该程序。

使用切除钳钳，固定卵巢，切成两半，并开始去除外部切片。确保从卵巢上切除不超过一到两毫米深的表面，以便不收集延髓。用手术刀切下三到四条薄薄的卵巢皮层，然后将条带放在第三个PBS填充的培养皿中。

用手术刀刀片将条带切成0.5至1立方毫米的小方形碎片。在培养皿下方使用尺子，以确保这些碎片具有相似的尺寸和厚度，以形成一致的卵巢皮层碎片。在所有三种PBS和抗生素现场培养皿中洗涤卵巢皮质片，使用弯曲的尖端镊子在洗涤之间移动这些碎片。

通过一系列LB-15洗涤器移动皮层碎片，并将它们放置在最终的LB-15填充培养皿中。在盖子上贴上动物ID和卵巢侧的标签。每个卵巢收集四个卵巢皮层碎片，并将它们固定在第零天组织学检查中，并冷冻额外的碎片进行RNA纯化。

使用剩余的组织块进行培养。准备生物安全柜，用于最终的组织洗涤和培养制备。在将用品放入生物安全柜之前，先用70%乙醇消毒用品。

将所有用于培养的卵巢皮层碎片移至生物安全柜，并在充满LB-15的培养皿中再次清洗。将每孔350微升Waymouth培养基移入24孔组织培养板中。使用镊子将未涂覆的培养孔插入每个孔中，确保在插入物的底部下不会形成气泡。

小心而精细地将四个卵巢皮层片放置在每个插入物的网状物上，而不会刺穿网状物。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育组织。每天更换卵巢皮层培养基，持续七天，确保使用预热的Waymouth培养基。

在培养基更换过程中，使用镊子轻轻地将插入物从孔中提起，并将培养的Waymouth培养基收集在0.5毫升管中。将插入物放回孔中，并通过在插入物侧面和孔之间分配来添加350微升新鲜培养基。将组织培养物中收集的培养基储存在零下20摄氏度。

经过七天的培养，使用带有相机和计算机成像软件程序的解剖显微镜对卵巢皮层碎片进行成像。在Bouin的组织学溶液中，每孔固定两个卵巢皮层片，并在液氮中快速冷冻到卵巢皮层片，以获得用于cDNA的RNA。对所有带有组织的孔重复此步骤，然后从第七天开始收集培养基并将其储存在零下20度。

让卵巢皮层块浸泡在Bouin的溶液中约1.5小时，然后用70%乙醇洗涤三次，将组织保持在70%乙醇中，每天清除，直到溶液不再变黄。对原始卵泡，早期原代卵泡，原发卵泡，次生卵泡和窦卵泡进行苏木精和曙红染色。在培养前后固定的卵巢皮层上进行卵泡分期，以评估卵泡发生。

由胶原沉积决定的形态差异可以表明从楼梯或控制小母牛的卵巢皮层纤维化。这里显示了对照和阶梯小母牛之间填充的每个卵巢皮层的picrosirius红色阳性染色的平均面积的比较。在三天内收集培养基，使用放射免疫测定法评估各种类固醇激素的产生。

在卵巢皮层培养基中，还测量了类固醇代谢物和细胞因子的产生，每只动物在四天的培养中汇集了一个孔。组织放置的时间越长，就越难处理。您可能需要练习精确切割。

该技术用于了解对信号转导途径的影响，以挽救过量的类固醇生成，以确定过量类固醇对细胞因子和趋化因子产生的影响，并确定对卵巢组织内卵泡进展或停滞的影响。