建立高通量表皮球体培养系统，以模拟角膜细胞干细胞可塑性

本协议提出了培养和维持表皮球体培养的新方法，以及使用球体重新镀质检测密切研究这些培养和维持的策略。首先准备文本手稿中描述的洗涤介质。在层压流罩中，用五毫升的洗涤介质在五毫升圆锥管中两次清洗新生儿前皮，然后将洗过的前体转移到无菌的培养皿中。

使用手术刀和钳子，刮掉皮肤层的脂肪组织和松散的结缔组织，然后用洗涤介质重新洗净前皮。将包皮表皮侧放在一个六井板中，其中含有在洗涤介质中稀释的两毫升迪斯帕酶。将盘子转移到孵化器上四个小时。

孵化后，将前皮转移到培养皿中，并使用细尖钳子将表皮与真皮层分离。将表皮放入一个15毫升圆锥管中，其中含有2毫升0.25%的特里普辛-EDTA。使用五毫升血清学移液器粉碎漂浮的表皮，在37摄氏度下孵育15分钟，周期性涡流每5分钟5秒。

孵化后，加入两毫升大豆试丁香抑制剂，通过管道混合以中和试丁香，然后离心细胞悬浮。将颗粒重新放入12毫升完整的KSFM-SCM介质中，并将细胞放入10厘米的盘中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下过夜孵育。第二天，使用吸气移液器取出介质，代之以 12 毫升完整的 KSFM-SCM。

在四日和七日重复上述步骤。在 100 毫升玻璃瓶中加入 2.5 克阿加罗斯到 50 毫升 PBS，准备 5% 的玫瑰混合物。将瓶子高压到液体循环中，使其冷却至室温。

要准备盘子，将装有阿加罗斯溶液的冷却玻璃放入一升烧杯中，里面装满了 200 毫升的去离子水。将阿加罗斯混合物在研究级微波炉中熔化长达两分钟，每 60 秒将阿加罗斯混合一次，轻轻地将瓶子侧向侧倾斜。在 42 摄氏度的预制 KSFM-SCM 中加入 3 毫升融化的 5% 阿加罗斯到 12 毫升预制 KSFM-SCM，最终浓度为 1%。

使用多通道管道将 1% agar 混合物的 200 微升添加到 96 井板的每口井中。然后将盘子放在25摄氏度的无菌环境中四个小时。通过吸气介质和在两毫升PBS中清洗细胞形成正常的人类角蛋白细胞。

吸气PBS，并在洗涤细胞中加入两毫升0.25%的三苯蛋白-EDTA。然后在37摄氏度下孵育5分钟。孵化后，在板中加入两毫升大豆试丁银抑制剂，将板中的细胞洗入15毫升管中。

离心机在 250 倍 G 五分钟。将细胞颗粒重新吸收在一毫升的PBS中，然后使用Trypan蓝色染色对细胞进行量化。在KSFM-SCM的100微升中，在2万个普通的人类角蛋白细胞中，在先前准备的96井板中每口井中播种细胞。

然后在一夜之间孵化盘子。使用倒置相对比显微镜，分析种子井以形成表皮球体。3D 表皮球体形成后 24 到 48 小时，在 37 摄氏度下在 6 厘米的盘中加入 4 毫升预制 KSFM-SCM。

使用宽孔一毫升移液器尖端，将单个球体转移到板中，并在一夜之间孵育板。使用倒置相对比显微镜分析种子球体以连接或繁殖细胞。通过去除介质并在板中加入两毫升新鲜 KSFM-SCM 介质，每 96 小时给细胞喂一次。

通道 70 到 80% 汇流球体衍生的正常人类角膜细胞和 2D 单层培养物，如前所述。然后使用 Trypan 蓝色和自动电池计数器量化细胞的生存能力。阿利奎特100微升含有10万至400万普通人类角蛋白细胞成1.5毫升微中心管。

将管子放在冰上，在黑暗的环境中关闭层罩内的明亮灯光。在管中加入两个FITC结合的抗集成蛋白α六微升和两个PE结合抗EGFR微升，实现一到50的稀释。准备一个没有添加抗体的管子，作为未染色的控制。

在黑暗中将管子在冰上孵育30分钟。使用适当的激光进行流细胞学分析。使用负控和正控件来建立闸门。

对表皮干细胞分数、增殖祖细胞分数和承诺祖细胞分数的亚群进行排序。通过将每个分拣管的含量转移到一个15毫升圆锥管中，其中包含PBS中分拣细胞体积的10倍，测试分拣细胞子群的增殖能力。以 250 倍 G 离心管，时间为 5 分钟。

取出超高颗粒，将颗粒重新浸入四毫升KSFM-SCM中。将再悬存的细胞转移到6厘米的板中，在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中过夜，湿度为95%。第二天，从盘子中取出介质，每三天在37摄氏度下加入4毫升预制KSFM-SCM，直至达到70%至80%的汇合度。

使用皮肤表皮球体检测评估了3D培养中正常人类角膜细胞的自主表皮球体形成能力。非球形细胞聚集不被视为足够的表皮球体形成。密集球形聚合被认为是自发球形形成的标志。

有必要使用超过两倍的10到四个细胞，以确保适当的自发聚集。在二维文化中种植表皮球体导致小尺寸的可行正常人类角膜细胞的增殖。重要的是保持这些文化低于100%汇流，因为这会大大损害他们的成长和干细胞状态的文化。

表皮球体形成过程通过荧光记者在单细胞水平上进行功能跟踪。球状衍生的正常人类角膜细胞亚聚合物是集成蛋白α六高和EGF是低细胞。细胞通常占培养物的25%左右。

通过对基底细胞角蛋白14和肿瘤蛋白63的免疫染色分析，实现了这种干状角膜细胞亚群的特征。球体重新镀质检测是从新生儿皮肤中富集表皮干细胞的有效策略。该系统可作为高通量细胞模型，用于研究皮肤疾病，如伤口愈合和癌症。