פרוטוקול זה מציג שיטה חדשנית לטיפוח ותחזוקה של תרביות כדור אפידרמיס, ואת האסטרטגיה לחקור אותם מקרוב באמצעות הבדיקה התזרימית של הספרואיד. התחל בהכנת מדיום כביסה כמתואר בכתב היד של הטקסט. במכסה המנוע של זרם למינאר, יש לשטוף עורלה יילודים פעמיים עם חמישה מיליליטר של מדיית כביסה בצינור חרוטי של חמישה מיליליטר, ואז להעביר את עורלה שטופה לצלחת פטרי סטרילית.
באמצעות אזמל ומלקחיים, לגרד את רקמת השומן ורקמות חיבור רופף מן השכבה העורית, ולאחר מכן לשטוף את העורלה עם מדיה לשטוף. מניחים את האפידרמיס המעולה בצד למעלה בצלחת של שש בארות המכילה שני מיליליטר של אנזים דיפאז מדולל במדיה לשטוף. מעבירים את הצלחת לאינקובטור במשך ארבע שעות.
לאחר הדגירה, מעבירים את העורלה לצלחת פטרי ומשתמשים במלקחיים עדינים כדי להפריד את האפידרמיס משכבה הדרמיס. מניחים את האפידרמיס לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של 0.25%טריפסין-EDTA. לרסק את האפידרמיס הצף באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר ודגור אותו במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם מערבולת תקופתית במשך חמש שניות כל חמש דקות.
לאחר הדגירה, להוסיף שני מיליליטר של מעכב טריפסין סויה ולערבב אותו על ידי pipetting כדי לנטרל את טריפסין, ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא. resuspend הכדור ב 12 מיליליטר של בינוני KSFM-SCM להשלים צלחת את התאים בצלחת 10 ס"מ לדגור בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להסיר את המדיום באמצעות pipette שאפתן ולהחליף אותו עם 12 מיליליטר של KSFM-SCM מלא.
חזור על זה בימים 4 ו -7. הכן 5% תערובת אגרוז על ידי הוספת 2.5 גרם של אגרוז ל 50 מיליליטר של PBS בבקבוק זכוכית 100 מיליליטר. יש להקם את הבקבוק אוטומטית למחזור הנוזלי ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
להכנת צלחות, מניחים את הזכוכית מקוררת המכילה תמיסת אגרוז בכוס ליטר אחת מלאה ב -200 מיליליטר של מים דהויים. ממיסים את תערובת האגורוז במיקרוגל ברמת מחקר עד שתי דקות, ומערבבים את האגורוז כל 60 שניות על ידי הטיה עדינה של הבקבוק מצד לצד. הוסף שלושה מיליליטר של נמס 5%agarose ל 12 מיליליטר של KSFM-SCM מטען מראש ב 42 מעלות צלזיוס לריכוז סופי של 1%agarose.
הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תערובת אגר 1% לכל באר של צלחת 96 באר באמצעות pipetter רב ערוצי. ואז להשאיר את הצלחת בסביבה סטרילית ב 25 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. מעבר כדורי יצירת קרטינוציטים אנושיים נורמליים על ידי שאיפה מדיה ותאי כביסה בשני מיליליטר של PBS.
שאפו PBS והוסיפו שני מיליליטר של 0.25%טריפסין-EDTA לתאים השטופים. ואז לדגור במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להוסיף שני מיליליטר של מעכב טריפסין סויה לצלחת ולשטוף את התאים מהצלחת לתוך צינור 15 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 250 פעמים G במשך חמש דקות. resuspend גלולה התא מיליליטר אחד של PBS ולכמת את התאים באמצעות מכתים כחול טריפן. Aliquot 20, 000 קרטינוציטים אנושיים נורמליים ב 100 microliters של KSFM-SCM ולזרוע את התאים בכל באר של צלחת 96-באר שהוכן בעבר.
ואז לדגור על הצלחת בן לילה. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, לנתח את הבארות זרעים להיווצרות כדור אפידרמיס. 24 עד 48 שעות לאחר היווצרות כדור אפידרמיס תלת מימדי, להוסיף ארבעה מיליליטר של KSFM-SCM מחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס לצלחת שישה סנטימטרים.
בעזרת קצה פיפטה רחב של מיליליטר אחד, מעבירים כדורי יחיד לצלחת ודגר את הצלחת למשך הלילה. נתח את כדורי הזרעים להצמדה או הפצה של תאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך. להאכיל תאים כל 96 שעות על ידי הסרת המדיה והוספת שני מיליליטר של מדיה KSFM-SCM טרי לצלחת.
מעבר 70 עד 80%קרטינוציטים אנושיים רגילים שמקורם בפרנואידים ותרבויות מונו-שכבתיות דו-שכבתיות כפי שהודגמו בעבר. לאחר מכן כימת את הכדאיות של התא באמצעות טריפאן כחול ומונה תאים אוטומטי. Aliquot 100 מיקרוליטרים המכילים 100, 000 עד 4 מיליון קרטינוציטים אנושיים רגילים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
מניחים את הצינורות על קרח בסביבה חשוכה על ידי כיבוי האורות הבהירים בתוך מכסה המנוע למינאר. הוסף שני מיקרוליטרים של אלפא אנטי-אינטיגרין מצומדים FITC שש ושני מיקרוליטרים של אנטי EGFR מצומד PE לצינורות כדי להשיג דילול אחד עד 50. הכן צינור ללא נוגדנים שנוספו לשמש כשליטה לא מוכתמת.
לדגור על הצינורות על קרח בחושך במשך 30 דקות. בצע ניתוח ציטומטריית זרימה עם לייזרים מתאימים. השתמש בבקרות השליליות והחיוביות כדי להקים שערים.
מיין את תת-האב של שבר תאי גזע אפידרמליים, את שבר תא האב המתרבה, ואת שבר תא האב המחויב. בדוק קיבולת שגשוג של תת-אוכלוסין של תאים ממוינים על ידי העברת התוכן של כל צינור מיון בהתאמה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 10 פעמים את נפח התאים ממוינים ב- PBS. צנטריפוגה הצינורות ב 250 פעמים G במשך חמש דקות.
הסר את supernatant ו resuspend הכדור בארבעה מיליליטר של KSFM-SCM. מעבירים את התאים המחודשים לצלחת של שישה ס"מ ודגרים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני עם 95% לחות. למחרת, להסיר מדיה מן הצלחות ולהוסיף ארבעה מיליליטר של KSFM-SCM מחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס כל שלושה ימים עד 70 עד 80% conencency הוא הגיע.
יכולת אפידרמיס אוטונומית היוצרת פרנואידים של קרטינוציטים אנושיים נורמליים בתרבות תלת-ממדית הוערכה באמצעות בדיקת כדור האפידרמיס של העור. צבירת תאים לא כדוריים לא נחשבה להיווצרות ספירת אפידרמיס נאותה. צבירה צפופה בצורת כדור נחשבה לסימן היכר של היווצרות כדורית ספונטנית.
היה צורך להשתמש ביותר משתיים כפול 10 לארבעת התאים כדי להבטיח צבירה ספונטנית נכונה. שתילת כדורי אפידרמיס בתרבות דו-פעמית הביאה להתפשטות של קרטינוציטים אנושיים רגילים בגודל קטן. חשוב לשמור על תרבויות אלה מתחת ל-100% השפעה, שכן הדבר עלול לפגוע במידה ניכרת בצמיחתן ובמצב תאי הגזע שלהן בתרבות.
תהליך היווצרות כדורי אפידרמיס היה במעקב פונקציונלי ברמת התא הבודד על ידי תאים שהודבקו עם כתב פלואורסצנטי. תת-אכלוס קרטינוציטים אנושיים רגילים שמקורם בספרואיד הם אינטגרין אלפא שש גבוהים ו- EGF הם תאים נמוכים. התאים מהווים בדרך כלל כ -25% מהתרבויות.
אפיון זה דמוי גזע קרטינוציט תת-אוכלוסין הושג על ידי ניתוח חיסוני של ציטוקרטין בזאלי 14 וחלבון הגידול 63. בדיקת הנטייה מחדש של כדורית היא אסטרטגיה יעילה להעשרת תאי גזע אפידרמליים מעור אנושי יילודים. מערכת זו יכולה להיות מועסקת כמודל מבוסס תא תפוקה גבוהה לחקור מחלות עוריות כגון ריפוי פצעים וסרטן.
