Bu protokol, epidermal küre kültürlerinin yetiştirilmesi ve sürdürülmesi için yeni bir yöntem ve küresel sıçrama testini kullanarak bunları yakından araştırma stratejisini sunar. Metin el yazmasında açıklandığı gibi yıkama ortamı hazırlayarak başlayın. Laminer akış davlumbazında, yenidoğan sünnet derisi beş mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre yıkama ortamı ile iki kez yıkayın, ardından yıkanmış sünnet derisi steril bir Petri kabına aktarın.
Neşter ve forseps kullanarak, yağ dokusunu ve gevşek bağ dokularını dermal tabakadan kazıyın, ardından önkiyi yıkama ortamıyla yeniden yıkayın. Foreskin epidermis tarafını yıkama ortamlarında seyreltilmiş iki mililitre Dispase enzimi içeren altı kuyulu bir tabağa yerleştirin. Plakayı dört saat boyunca bir inkübatöre aktarın.
Kuluçkadan sonra, foreskin'i bir Petri kabına aktarın ve epidermisi dermis tabakasından ayırmak için ince uçlu forseps kullanın. Epidermisi% 0.25 Trypsin-EDTA'nın iki mililitresini içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Yüzen epidermisi beş mililitre serolojik pipet kullanarak ezin ve her beş dakikada beş saniye periyodik girdap ile 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, iki mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve tripsin nötralize etmek için pipetleme yaparak karıştırın, ardından hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Peletin 12 mililitrelik tam KSFM-SCM ortamında yeniden biriktirin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gecede kuluçkaya yatmak için 10 santimetrelik bir tabakta plakalayın. Ertesi gün, emişli bir pipet kullanarak ortamı çıkarın ve 12 mililitre komple KSFM-SCM ile değiştirin.
Bunu dördüncü ve yedinci günlerde tekrarlayın. 100 mililitrelik bir cam şişeye 50 mililitre PBS'ye 2,5 gram agarose ekleyerek% 5 agarose karışımı hazırlayın. Şişeyi sıvı döngüsüne otoklavlayın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Plaka hazırlamak için, agarose çözeltisi içeren soğutulmuş camı 200 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir litrelik bir behere yerleştirin. Agarose karışımını araştırma sınıfı bir mikrodalga fırında iki dakikaya kadar eritin, şişeyi hafifçe yana yatırarak agaroseyu her 60 saniyede bir karıştırın. Son konsantrasyon için 42 santigrat derecede 12 mililitre önceden ısıtılan KSFM-SCM'ye üç mililitre erimiş%5 agarose ekleyin.
Çok kanallı bir pipetter kullanarak 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna%1 agar karışımının 200 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra plakayı dört saat boyunca 25 santigrat derecede steril bir ortamda bırakın. Pasaj sferoid oluşturan normal insan keratinositleri, medyayı aspire ederek ve hücreleri iki mililitre PBS'de yıkayarak.
PBS'yi aspire edin ve yıkanmış hücrelere iki mililitre %0,25 Trypsin-EDTA ekleyin. Sonra 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yaslanın. Kuluçkadan sonra, tabağa iki mililitre soya tripsin inhibitörü ekleyin ve tabaktan hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe yıkayın.
Beş dakika boyunca 250 kat G'de santrifüj. Hücre peletini bir mililitre PBS'de yeniden biriktirin ve Trypan Blue boyama kullanarak hücreleri ölçün. Aliquot 20,000 KSFM-SCM 100 mikrolitresinde normal insan keratinositleri ve daha önce hazırlanmış 96 kuyu plakasının her kuyusundaki hücreleri tohumlayın.
Sonra plakayı bir gecede kuluçkaya yatır. Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak, epidermis küre oluşumu için tohumlu kuyuları analiz edin. 3D epidermis küre oluşumundan 24 ila 48 saat sonra, altı santimetrelik bir yemeğe 37 santigrat derecede dört mililitre önceden ısınmış KSFM-SCM ekleyin.
Geniş bir delikli bir mililitre pipet ucu kullanarak, plakaya tek bir küresel aktarın ve plakayı bir gecede kuluçkaya yayalım. Ters faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri takmak veya yaymak için tohumlu küreseli analiz edin. Ortamı çıkararak ve plakaya iki mililitre taze KSFM-SCM ortam ekleyerek her 96 saatte bir hücreleri besleyin.
Pasaj 70 ila% 80 birleştirilmiş küresel türevli normal insan keratinositleri ve daha önce gösterildiği gibi 2D monolayer kültürler. Ardından Trypan Blue ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ölçün. Aliquot 100 mikrolitreleri 100,000 ila 4 milyon normal insan keratinositini 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine içerir.
Laminar kaputun içindeki parlak ışıkları kapatarak tüpleri karanlık bir ortamda buzun üzerine yerleştirin. Bir ila 50 seyreltme elde etmek için tüplere iki mikrolitre FITC konjuge anti-integrin alfa altı ve iki mikrolitre PE-konjuge anti-EGFR ekleyin. Tespit edilmemiş kontrol görevi görmek için antikor eklenmemiş bir tüp hazırlayın.
Tüpleri karanlıkta 30 dakika boyunca buzun üzerinde kuluçkaya yatır. Uygun lazerlerle akış sitometrisi analizi yapın. Kapıları kurmak için negatif ve pozitif kontrolleri kullanın.
Epidermal kök hücre fraksiyonunun, proliferatif progenitör hücre fraksiyonunun ve taahhüt edilen progenitör hücre fraksiyonunun alt nüfusunu sıralayın. Her bir sıralama tüpünün içeriğini PBS'deki sıralanmış hücrelerin hacminin 10 katını içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak sıralanmış hücre alt nüfuslarının proliferatif kapasitesini test edin. Tüpleri beş dakika boyunca 250 kat G'de santrifüjleyin.
Üst düğmeyi çıkarın ve peletin dört mililitre KSFM-SCM'de yeniden süzülün. Yeniden dürtülen hücreleri altı santimetrelik bir plakaya aktarın ve %95 neme sahip%5 karbondioksit inkübatöründe gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakalardan medyayı çıkarın ve% 70 ila% 80 izdiah edilene kadar her üç günde bir 37 santigrat derecede dört mililitre önceden ısıtılan KSFM-SCM ekleyin.
3D kültürde normal insan keratinositlerinin otonom epidermal sferoid oluşturma yeteneği cilt epidermis küre tahlili kullanılarak değerlendirildi. Küresel olmayan hücre toplama yeterli epidermis küre oluşumu olarak kabul edilmemiştir. Yoğun küre şeklindeki toplama, spontan seküler seküler oluşumun bir özelliği olarak kabul edildi.
Uygun spontan toplamayı sağlamak için dört hücreye iki kereden fazla 10 kullanmak gerekiyordu. Epidermis kürelerinin 2D kültüre dikilmesi, küçük boyutlu uygulanabilir normal insan keratinositlerinin çoğalmasına neden oldu. Bu kültürlerin %100'ün altında tutulması önemlidir, çünkü bu durum kültürdeki büyümelerini ve kök hücre durumlarını önemli ölçüde bozabilir.
Epidermal sferoid oluşum süreci, floresan bir muhabir ile transfekte hücreler tarafından tek hücre düzeyinde fonksiyonel olarak izlendi. Küresel kökenli normal insan keratinositleri subpopülasyonu integrin alfa altı yüksek ve EGF düşük hücrelerdir. Hücreler genellikle kültürlerin yaklaşık% 25'ini oluşturuyor.
Bu kök benzeri keratinosit subpopülasyonunun karakterizasyonu bazal sitokeratin 14 ve tümör proteini 63'ün immünostaining analizi ile elde edildi. Küresel sıçrama tahlili, yenidoğan insan derisinden epidermal kök hücre zenginleştirme için etkili bir stratejidir. Bu sistem, yara iyileşmesi ve kanser gibi kesitli hastalıkları araştırmak için yüksek verimli hücre bazlı bir model olarak kullanılabilir.
