Este protocolo presenta un método novedoso para el cultivo y mantenimiento de cultivos de esferas epidérmicas, y la estrategia para investigarlos de cerca utilizando el ensayo de replantación de esferoides. Comience preparando el medio de lavado como se describe en el manuscrito de texto. En una campana de flujo laminar, lave el prepucio neonatal dos veces con cinco mililitros de medios de lavado en un tubo cónico de cinco mililitros, luego transfiera el prepucio lavado a una placa de Petri estéril.
Con un bisturí y un bórceps, raspe el tejido adiposo y los tejidos conectivos sueltos de la capa dérmica, luego vuelva a lavar el prepucio con medios de lavado. Coloque la epidermis del prepucio hacia arriba en una placa de seis ormentos que contenga dos mililitros de enzima Dispasa diluida en medios de lavado. Transfiera la placa a una incubadora durante cuatro horas.
Después de la incubación, transfiera el prepucio a una placa de Petri y use forrórceps de punta fina para separar la epidermis de la capa de la dermis. Coloque la epidermis en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25%. Triturar la epidermis flotante con una pipeta serológica de cinco mililitros e incubarla durante 15 minutos a 37 grados centígrados con vórtice periódico durante cinco segundos cada cinco minutos.
Después de la incubación, agregue dos mililitros de inhibidor de tripsina de soja y mézclelo mediante pipeteo para neutralizar la tripsina, luego centrífuga la suspensión celular. Resuspend el pellet en 12 mililitros de medio KSFM-SCM completo y coloca las células en un plato de 10 centímetros para incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire el medio con una pipeta aspiradora y reemplácelo con 12 mililitros de KSFM-SCM completo.
Repita esto en los días cuatro y siete. Prepare una mezcla de 5% de agarosa agregando 2.5 gramos de agarosa a 50 mililitros de PBS en una botella de vidrio de 100 mililitros. Autoclave la botella en el ciclo de líquido y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
Para preparar los platos, coloque el vaso enfriado que contiene la solución de agarosa en un vaso de precipitados de un litro lleno de 200 mililitros de agua desionizada. Derrita la mezcla de agarosa en un microondas de grado de investigación durante un tiempo de hasta dos minutos, mezclando la agarosa cada 60 segundos inclinando suavemente la botella de lado a lado. Agregue tres mililitros de agarosa derretida al 5% a 12 mililitros de KSFM-SCM precalentado a 42 grados Celsius para una concentración final de 1% de agarosa.
Agregue 200 microlitros de la mezcla de 1% de agar a cada pozo de una placa de 96 pozos usando un pipete multicanal. Luego deje la placa en un ambiente estéril a 25 grados centígrados durante cuatro horas. Pasa queratocitos humanos normales formadores de esferoides mediante medios de aspiración y células de lavado en dos mililitros de PBS.
Aspire PBS y agregue dos mililitros de Tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Luego incuba durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue dos mililitros de inhibidor de tripsina de soja a la placa y lave las células de la placa en un tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos. Resuspenda el pellet celular en un mililitro de PBS y cuantifique las células utilizando la tinción Trypan Blue. Alícuota 20.000 queratinocitos humanos normales en 100 microlitros de KSFM-SCM y siembra las células en cada pozo de la placa de 96 pozos previamente preparada.
Luego incuba el plato durante la noche. Usando un microscopio de contraste de fase invertida, analice los pozos sembrados para la formación de la esfera de la epidermis. De 24 a 48 horas después de la formación de la esfera de la epidermis en 3D, agregue cuatro mililitros de KSFM-SCM precalentado a 37 grados Celsius a un plato de seis centímetros.
Usando una punta de pipeta de un mililitro de diámetro ancho, transfiera un solo esferoide a la placa e incube la placa durante la noche. Analice el esferoide sembrado para unir o propagar células utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. Alimente las células cada 96 horas retirando el medio y agregando dos mililitros de medios KSFM-SCM frescos a la placa.
Paso 70 a 80% de queratinocitos humanos normales derivados de esferoides confluentes y cultivos monocapa 2D como se demostró anteriormente. A continuación, cuantifique la viabilidad de la célula utilizando Trypan Blue y un contador de células automatizado. Alícuota de 100 microlitros que contienen de 100.000 a 4 millones de queratinocitos humanos normales en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Coloque los tubos sobre hielo en un ambiente oscuro apagando las luces brillantes dentro de la campana laminar. Agregue dos microlitros de anti-integrina alfa seis conjugada con FITC y dos microlitros de anti-EGFR conjugado con PE a los tubos para lograr una dilución de uno a 50. Prepare un tubo sin anticuerpos agregados para que sirva como control no manchado.
Incubar los tubos en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Realice análisis de citometría de flujo con los láseres apropiados. Use los controles negativo y positivo para establecer puertas.
Ordenar la subpoblación de la fracción de células madre epidérmicas, la fracción de células progenitoras proliferativas y la fracción de células progenitoras comprometidas. Pruebe la capacidad proliferativa de las subpoblaciones de células clasificadas transfiriendo el contenido de cada tubo de clasificación respectivo a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 10 veces el volumen de células clasificadas en PBS. Centrifugar los tubos a 250 veces G durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en cuatro mililitros de KSFM-SCM. Transfiera las células resuspendidas a una placa de seis centímetros e incube durante la noche a 37 grados Centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% con un 95% de humedad. Al día siguiente, retire los medios de las placas y agregue cuatro mililitros de KSFM-SCM precalentado a 37 grados Celsius cada tres días hasta que se alcance una confluencia del 70 al 80%.
La capacidad autónoma de formación de esferoides epidérmicos de queratinocitos humanos normales en cultivo 3D se evaluó mediante el ensayo de esfera de epidermis cutánea. La agregación celular no esférica no se consideró como una formación adecuada de la esfera de la epidermis. La agregación densa en forma de esfera se consideró un sello distintivo de la formación espontánea de esferoides.
Fue necesario utilizar más de dos veces 10 a las cuatro células para asegurar una agregación espontánea adecuada. La plantación de esferas de epidermis en cultivo 2D resultó en la proliferación de queratinocitos humanos normales viables de pequeño tamaño. Es importante mantener estos cultivos por debajo del 100% de confluencia, ya que esto puede afectar considerablemente su crecimiento y el estado de las células madre en cultivo.
El proceso de formación de esferoides epidérmicos fue rastreado funcionalmente a nivel de una sola célula por células transfectadas con un reportero fluorescente. La subpoblación de queratinocitos humanos normales derivados de esferoides es integrina alfa seis alta y EGF son células bajas. Las células generalmente constituyen alrededor del 25% de los cultivos.
La caracterización de esta subpoblación de queratinocitos similares al tallo se logró mediante el análisis de inmunotinción de la citoqueratina basal 14 y la proteína tumoral 63. El ensayo de replatación de esferoides es una estrategia efectiva para el enriquecimiento de células madre epidérmicas de la piel humana neonatal. Este sistema se puede emplear como un modelo basado en células de alto rendimiento para investigar enfermedades cutáneas como la cicatrización de heridas y el cáncer.
