Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode für die Kultivierung und Aufrechterhaltung epidermaler Kugelkulturen und die Strategie vor, sie mit dem Spheroid-Replating-Assay genau zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Waschmediums, wie im Textmanuskript beschrieben. In einer Laminar-Flow-Dunstabzugshaube die neonatale Vorhaut zweimal mit fünf Millilitern Waschmedien in einem fünf Milliliter konischen Röhrchen waschen und dann die gewaschene Vorhaut in eine sterile Petrischale überführen.
Mit Skalpell und Einer Zette Fettgewebe und loses Bindegewebe von der Hautschicht abkratzen und dann die Vorhaut mit Waschmitteln erneut waschen. Legen Sie die Vorhautepidermis mit der Seite nach oben in eine Sechs-Well-Platte, die zwei Milliliter Dispase-Enzym enthält, das in Waschmedien verdünnt ist. Die Platte für vier Stunden in einen Inkubator geben.
Nach der Inkubation die Vorhaut in eine Petrischale geben und mit einer Feinspitzenzette die Epidermis von der Dermisschicht trennen. Legen Sie die Epidermis in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin-EDTA. Zerdrücken Sie die schwimmende Epidermis mit einer serologischen Pipette von fünf Millilitern und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit periodischem Wirbeln für fünf Sekunden alle fünf Minuten.
Nach der Inkubation zwei Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor hinzufügen und durch Pipettieren mischen, um das Trypsin zu neutralisieren, dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Das Pellet in 12 Millilitern komplettem KSFM-SCM-Medium resuspendieren und die Zellen in einer 10-Zentimeter-Schüssel plattieren, um sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu inkubieren. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium mit einer Ansaugpipette und ersetzen es durch 12 Milliliter komplettes KSFM-SCM.
Wiederholen Sie dies an den Tagen vier und sieben. Bereiten Sie 5% Agarosemischung vor, indem Sie 2,5 Gramm Agarose zu 50 Milliliter PBS in einer 100 Milliliter Glasflasche hinzufügen. Autoklavieren Sie die Flasche auf den Flüssigkeitskreislauf und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
Um Platten vorzubereiten, legen Sie das gekühlte Glas mit Agaroselösung in ein Ein-Liter-Becherglas, das mit 200 Millilitern entionisiertem Wasser gefüllt ist. Schmelzen Sie die Agarosemischung in einer Mikrowelle in Forschungsqualität für bis zu zwei Minuten und mischen Sie die Agarose alle 60 Sekunden, indem Sie die Flasche vorsichtig von Seite zu Seite neigen. Fügen Sie drei Milliliter geschmolzene 5% Agarose zu 12 Millilitern vorgewärmtem KSFM-SCM bei 42 Grad Celsius für eine Endkonzentration von 1% Agarose hinzu.
Fügen Sie 200 Mikroliter der 1% Agarmischung mit einem Mehrkanalpipetter zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu. Dann lassen Sie die Platte in einer sterilen Umgebung bei 25 Grad Celsius für vier Stunden. Passage sphäroidbildende normale menschliche Keratinozyten durch Absaugen von Medien und Waschen von Zellen in zwei Millilitern PBS.
Saugen Sie PBS ab und geben Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA zu den gewaschenen Zellen. Anschließend fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation zwei Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor auf die Platte geben und die Zellen von der Platte in ein 15-Milliliter-Röhrchen waschen.
Zentrifuge bei 250 mal G für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS und quantifizieren Sie die Zellen mit Trypan Blue-Färbung. Aliquot 20.000 normale menschliche Keratinozyten in 100 Mikroliter KSFM-SCM und säen die Zellen in jeder Vertiefung der zuvor präparierten 96-Well-Platte.
Dann inkubieren Sie den Teller über Nacht. Analysieren Sie mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop die ausgesäten Vertiefungen auf epidermiskugelbildung. 24 bis 48 Stunden nach der Bildung der 3D-Epidermiskugel fügen Sie vier Milliliter vorgewärmtes KSFM-SCM bei 37 Grad Celsius zu einer sechs Zentimeter großen Schüssel hinzu.
Mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung einen Milliliter auf die Platte übertragen und die Platte über Nacht inkubieren. Analysieren Sie das gesäte Sphäroid zum Anbringen oder Vermehren von Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop. Füttern Sie die Zellen alle 96 Stunden, indem Sie das Medium entfernen und zwei Milliliter frischeS KSFM-SCM-Medien auf die Platte geben.
Passage 70 bis 80% konfluente Sphäroid-abgeleitete normale menschliche Keratinozyten und 2D-Monoschichtkulturen, wie zuvor gezeigt. Dann quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler. Aliquot 100 Mikroliter mit 100.000 bis 4 Millionen normalen menschlichen Keratinozyten in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen.
Stellen Sie die Rohre in einer dunklen Umgebung auf Eis, indem Sie die hellen Lichter in der laminaren Motorhaube ausschalten. Geben Sie zwei Mikroliter FITC-konjugiertes Anti-Integrin alpha six und zwei Mikroliter PE-konjugiertes Anti-EGFR in die Röhrchen, um eine Verdünnung von eins bis 50 zu erreichen. Bereiten Sie ein Röhrchen ohne Antikörper vor, das als ungefärbte Kontrolle dient.
Inkubieren Sie die Röhren 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Führen Sie Eine Durchflusszytometrie-Analyse mit geeigneten Lasern durch. Verwenden Sie die Negativ- und Positivkontrollen, um Tore einzurichten.
Sortieren Sie die Subpopulation der epidermalen Stammzellfraktion, der proliferativen Vorläuferzellfraktion und der gebundenen Vorläuferzellfraktion. Testen Sie die proliferative Kapazität sortierter Zellsubpopulationen, indem Sie den Inhalt des jeweiligen Sortierröhrchens in ein 15-Milliliter-Konusröhrchen übertragen, das das 10-fache volumen sortierter Zellen in PBS enthält. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 mal G für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und brauen Sie das Pellet in vier Milliliter KSFM-SCM wieder auf. Die resuspendierten Zellen auf eine sechs Zentimeter große Platte geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator mit 95% Luftfeuchtigkeit inkubieren. Am nächsten Tag das Medium von den Platten entfernen und alle drei Tage vier Milliliter vorgewärmtes KSFM-SCM bei 37 Grad Celsius hinzufügen, bis 70 bis 80% Konfluenz erreicht sind.
Die autonome epidermale Sphäroidbildungsfähigkeit normaler menschlicher Keratinozyten in 3D-Kultur wurde mit dem Hautepidermissphärenassay beurteilt. Die nicht-sphärische Zellaggregation wurde nicht als ausreichende Epidermissphärenbildung angesehen. Dichte kugelförmige Aggregation galt als Kennzeichen der spontanen Sphäroidbildung.
Es war notwendig, mehr als zweimal 10 zu den vier Zellen zu verwenden, um eine ordnungsgemäße spontane Aggregation zu gewährleisten. Das Pflanzen von Epidermiskugeln in 2D-Kultur führte zur Proliferation eines kleinen lebensfähigen normalen menschlichen Keratinozyten. Es ist wichtig, diese Kulturen unter 100% Konfluenz zu halten, da dies ihr Wachstum und ihren Stammzellzustand in Kultur erheblich beeinträchtigen kann.
Der Prozess der epidermalen Sphäroidbildung wurde funktionell auf Einzelzellebene von transfizierten Zellen mit einem fluoreszierenden Reporter verfolgt. Sphäroid-abgeleitete normale menschliche Keratinozyten-Subpopulationen sind Integrin alpha sechs hoch und EGF sind niedrige Zellen. Die Zellen machen im Allgemeinen etwa 25% der Kulturen aus.
Die Charakterisierung dieser stammartigen Keratinozyten-Subpopulation wurde durch immunstainende Analyse von basalem Cytokeratin 14 und Tumorprotein 63 erreicht. Der Sphäroid-Replating-Assay ist eine effektive Strategie zur epidermalen Stammzellanreicherung aus der menschlichen Haut von Neugeborenen. Dieses System kann als zellbasiertes Hochdurchsatzmodell zur Untersuchung von Hauterkrankungen wie Wundheilung und Krebs eingesetzt werden.
