이 프로토콜은 표피 구 배양의 재배 및 유지 보수를 위한 새로운 방법과 스페로이드 레타칭 분석법을 사용하여 면밀히 조사하는 전략을 제시합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 세척 매체를 준비하여 시작합니다. 라미나르 플로우 후드에 5밀리리터의 세안 매체로 신생아 포피를 두 번 씻은 다음 세척된 포피를 멸균 페트리 접시로 옮겨냅니다.
메스와 집게를 사용하여 지방 조직을 긁어 내고 진피 층에서 느슨한 결합 조직을 긁어 낸 다음 세면 매체로 포피를 다시 씻어냅니다. 세차 매체에서 희석된 디스파스 효소 2밀리리터를 함유한 6웰 플레이트에 포피포 피더피 면을 올려 놓습니다. 접시를 인큐베이터로 4시간 동안 옮기.
인큐베이션 후 포피를 페트리 접시에 옮기고 미세 팁 집게를 사용하여 표피를 진피 층과 분리합니다. 표피를 0.25%의 트립신-EDTA 2밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 5 밀리리터 세로지 피펫을 사용하여 부동 표피를 분쇄하고 5 분마다 5 초 동안 주기적인 소용돌이와 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 콩 트립신 억제제의 두 밀리리터를 추가하고 트립신을 중화하기 위해 파이펫팅하여 혼합한 다음 세포 현탁액을 원심분리합니다. 완전한 KSFM-SCM 배지의 12 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 10센티미터 접시에 세포를 플레이트하여 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 매혹 파이펫을 사용하여 매체를 제거하고 완전한 KSFM-SCM의 12 밀리리터로 교체하십시오.
4일과 7일에 반복하십시오. 100 밀리리터 유리 병에 PBS의 50 밀리리터에 아가로즈 2.5 그램을 추가하여 5 %의 아가로즈 혼합물을 준비하십시오. 병을 액체 주기에 자동 복제하여 실온으로 냉각시하십시오.
접시를 준비하려면 아가로즈 용액이 들어 있는 냉각유리를 200밀리리터의 탈온화된 물로 채워진 1리터 비커에 놓습니다. 아가로즈 혼합물을 연구급 전자레인지에 최대 2분간 녹여 60초마다 아가로즈를 혼합하여 병쪽을 부드럽게 기울여 보틀을 좌우로 부드럽게 기울입니다. 녹인 5%아가로즈 3밀리리터를 섭씨 42도에 예동KSFM-SCM 12밀리리터에 첨가하여 최종 농도1%를 기록합니다.
멀티 채널 파이퍼터를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 1% 한고 믹스200 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 4 시간 동안 섭씨 25도에서 멸균 환경에서 접시를 둡니다. 파종 스페로이드 형성 정상적인 인간 각질 세포는 PBS의 두 밀리리터에서 미디어와 세척 세포를 흡입하여.
PBS를 흡인하고 세척 된 세포에 0.25 %의 트립신 -EDTA의 두 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 접시에 콩 트립신 억제제 2 밀리리터를 넣고 접시에서 세포를 15 밀리리터 튜브로 세척합니다.
5 분 동안 250 배 G에서 원심 분리기. PBS의 1 밀리 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 Trypan Blue 염색을 사용하여 세포를 정량화합니다. Aliquot 20, 000 KSFM-SCM의 100 마이크로리터에서 정상적인 인간 각질 세포와 이전에 준비된 96웰 플레이트의 각 우물에서 세포를 시드한다.
그런 다음 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 반전 된 상 대비 현미경을 사용하여 표피 구형성을 위해 시드 된 우물을 분석하십시오. 3D 표피 구체 형성 후 24~48시간, 섭씨 37도에 예동된 KSFM-SCM 4밀리리터를 6센티미터 접시에 추가합니다.
넓은 보어 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 단일 스페로이드를 플레이트에 옮기고 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 반전된 상 대비 현미경을 사용하여 세포를 부착하거나 전파하기 위해 시드 스페로이드를 분석합니다. 미디어를 제거하고 접시에 신선한 KSFM-SCM 매체의 2 밀리리터를 추가하여 96 시간마다 세포를 공급합니다.
통과 70 받는 사람 80% 컨물류 스페로이드 유래 정상적인 인간 각질 세포 및 2D 단층 배양 이전에 입증. 그런 다음 Trypan Blue와 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 가능성을 정량화합니다. 100, 000에서 4백만 개의 정상적인 인간 각질 세포를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 포함하는 Aliquot 100 마이크로리터.
라미나르 후드 내의 밝은 조명을 끄면 어두운 환경에서 튜브를 얼음 위에 놓습니다. FITC-컨쥬게이드 안티 인테그린 알파 6및 PE-컨쥬게이드 안티-EGFR의 2개의 마이크로리터를 튜브에 추가하여 1~50개의 희석을 달성합니다. 염색되지 않은 대조군역할을 하기 위해 항체가 첨가되지 않은 튜브를 준비합니다.
어둠 속에서 얼음에 튜브를 30분 동안 배양합니다. 적절한 레이저로 유동 세포 측정 분석을 수행합니다. 네거티브 및 양수 컨트롤을 사용하여 게이트를 설정합니다.
표피 줄기 세포 분획의 하위 인구, 증식 선조 세포 분획 및 헌신적인 전구 세포 분획을 정렬합니다. PBS에서 정렬된 세포의 10배의 부피를 포함하는 15밀리리터 원물 튜브로 각 각 정렬 튜브의 함량을 전송하여 정렬된 세포 하위 집단의 증식 능력에 대한 테스트. 5 분 동안 250 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 제거하고 KSFM-SCM의 4 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 재중단된 세포를 6센티미터 플레이트로 옮기고 습도가 95%인 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 미디어를 제거하고 70~80%의 합류까지 3일마다 37도에 미리 예동된 KSFM-SCM 4밀리리터를 추가합니다.
3D 배양에서 정상적인 인간 각질 세포의 자율표 피하 구체 형성 능력은 피부 표피 구체 분석체를 사용하여 평가되었다. 비구형 세포 집계는 적절한 표피 구형형성으로 간주되지 않았다. 조밀한 구형 응집은 자발적인 스페로이드 형성의 특징으로 간주되었다.
적절한 자발적 응집을 보장하기 위해 4개의 세포에 2회 이상 10번 이상 사용해야 했습니다. 2D 배양에 표피 구체를 심는 것은 작은 크기의 가능한 정상적인 인간 각질 세포의 증식을 초래했다. 이 상당히 그들의 성장과 배양에서 줄기 세포 상태를 손상시킬 수 있기 때문에 100% 연결 이하이 배양을 유지하는 것이 중요합니다.
표피 스페로이드 형성의 과정은 형광 기자와 함께 전염된 세포에 의해 단일 세포 수준에서 기능적으로 추적되었다. 스페로이드 유래 정상 인간 각질 세포 하위 집단은 인테그린 알파 6 하이및 EGF는 낮은 세포이다. 세포는 일반적으로 배양의 대략 25%를 구성합니다.
이러한 줄기와 같은 각질 세포 하위 집단의 특성화는 기저 세포각체(14)와 종양 단백질(63)의 면역염색 분석에 의해 달성되었다. 스페로이드 레래팅 분석은 신생아 인간의 피부에서 표피 줄기 세포 농축을위한 효과적인 전략이다. 이 시스템은 상처 치유 및 암과 같은 염분 질환을 조사하기 위해 고처리량 세포 기반 모델로 사용될 수 있다.
