Questo protocollo presenta un nuovo metodo per la coltivazione e il mantenimento di colture di sfere epidermiche e la strategia per studiarle da vicino utilizzando il test di replating sferoide. Inizia preparando il mezzo di lavaggio come descritto nel manoscritto del testo. In una cappa a flusso laminare, lavare due volte il prepuzio neonatale con cinque millilitri di mezzi di lavaggio in un tubo conico da cinque millilitri, quindi trasferire il prepuzio lavato in una capsula di Petri sterile.
Usando un bisturi e una pinze, raschiare via il tessuto adiposo e sciogliere i tessuti connettivi dallo strato dermico, quindi lavare di nuovo il prepuzio con mezzi di lavaggio. Posizionare l'epidermide del prepuzio con il lato in alto in una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di enzima Dispase diluiti in mezzi di lavaggio. Trasferire la piastra in un'incubatrice per quattro ore.
Dopo l'incubazione, trasferire il prepuzio in una capsula di Petri e utilizzare una pinna a punta fine per separare l'epidermide dallo strato del derma. Posizionare l'epidermide in un tubo conico da 15 millilitri contenente due millilitri di 0,25% tripsina-EDTA. Schiacciare l'epidermide galleggiante usando una pipetta sierologica da cinque millilitro e incubarla per 15 minuti a 37 gradi Celsius con vortice periodico per cinque secondi ogni cinque minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di inibitore della tripsina di soia e mescolarlo mediante pipettaggio per neutralizzare la tripsina, quindi centrifugare la sospensione cellulare. Risuscindi il pellet in 12 millilitri di mezzo KSFM-SCM completo e pianizza le celle in un piatto da 10 centimetri per incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo utilizzando una pipetta aspiratrice e sostituirlo con 12 millilitri di KSFM-SCM completo.
Ripeti questo nei giorni quattro e sette. Preparare la miscela di agarose al 5% aggiungendo 2,5 grammi di agarose a 50 millilitri di PBS in una bottiglia di vetro da 100 millilitri. Autoclavare la bottiglia sul ciclo del liquido e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
Per preparare i piatti, posizionare il vetro raffreddato contenente soluzione di agarose in un becher da un litro riempito con 200 millilitri di acqua deionizzata. Sciogliere la miscela di agarose in un forno a microonde di qualità di ricerca per un massimo di due minuti, mescolando l'agarose ogni 60 secondi inclinando delicatamente la bottiglia da un lato all'altro. Aggiungere tre millilitri di agarosio fuso al 5% a 12 millilitri di KSFM-SCM preriscaldato a 42 gradi Celsius per una concentrazione finale dell'1% di agarosio.
Aggiungere 200 microlitri della miscela di agar all'1% a ciascun pozzettino di una piastra da 96 pozzetti utilizzando un pipetter multicanale. Quindi lasciare la piastra in un ambiente sterile a 25 gradi Celsius per quattro ore. Passaggio sferoide-formando cheratinociti umani normali aspirando mezzi e lavando le cellule in due millilitri di PBS.
Aspirare PBS e aggiungere due millilitri di 0,25% tripsina-EDTA alle cellule lavate. Quindi incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di inibitore della tripsina di soia alla piastra e lavare le cellule dalla piastra in un tubo da 15 millilitri.
Centrifugare a 250 volte G per cinque minuti. Ricasospendare il pellet cellulare in un millilitro di PBS e quantificare le cellule utilizzando la colorazione Trypan Blue. Aliquot 20.000 cheratinociti umani normali in 100 microlitri di KSFM-SCM e seminano le cellule in ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi precedentemente preparata.
Quindi incubare il piatto durante la notte. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita, analizzare i pozzi seminati per la formazione della sfera dell'epidermide. Da 24 a 48 ore dopo la formazione della sfera dell'epidermide 3D, aggiungere quattro millilitri di KSFM-SCM preriscaldato a 37 gradi Celsius a un piatto di sei centimetri.
Utilizzando una punta di pipetta da un millilitro a foro largo, trasferire un singolo sferoide sulla piastra e incubare la piastra durante la notte. Analizzare lo sferoide seminato per attaccare o propagare le cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita. Alimenta le celle ogni 96 ore rimuovendo il supporto e aggiungendo due millilitri di supporti KSFM-SCM freschi alla piastra.
Passaggio dal 70 all'80% di cheratinociti umani normali derivati da sferoidi confluenti e colture monostrato 2D come precedentemente dimostrato. Quindi quantificare la vitalità cellulare utilizzando Trypan Blue e un contatore di celle automatizzato. Aliquot 100 microlitri contenenti da 100.000 a 4 milioni di cheratinociti umani normali in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Posizionare i tubi sul ghiaccio in un ambiente buio spegnendo le luci brillanti all'interno della cappa laminare. Aggiungere due microlitri di anti-integrina alfa sei coniugati con FITC e due microlitri di anti-EGFR coniugato con PE ai tubi per ottenere una diluizione da uno a 50. Preparare un tubo senza anticorpi aggiunti per servire come controllo non macchiato.
Incubare i tubi sul ghiaccio al buio per 30 minuti. Eseguire analisi di citometria a flusso con laser appropriati. Usa i controlli negativi e positivi per stabilire i cancelli.
Ordina la sottopopolazione di frazione di cellule staminali epidermiche, la frazione proliferativa progenitrice e la frazione di cellule progenitrici impegnate. Testare la capacità proliferativa di sottopopolazioni cellulari ordinate trasferendo il contenuto di ciascun tubo di selezione in un tubo conico da 15 millilitro contenente 10 volte il volume delle celle ordinate in PBS. Centrifugare i tubi a 250 volte G per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante e risuscivare il pellet in quattro millilitri di KSFM-SCM. Trasferire le cellule spese su una piastra di sei centimetri e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% con umidità del 95%. Il giorno successivo, rimuovere i supporti dalle piastre e aggiungere quattro millilitri di KSFM-SCM prebellico a 37 gradi Celsius ogni tre giorni fino a raggiungere il 70-80% di confluenza.
La capacità autonoma di formazione di sferoidi epidermici dei normali cheratinociti umani in coltura 3D è stata valutata utilizzando il test della sfera dell'epidermide cutanea. L'aggregazione cellulare non sferica non è stata considerata come un'adeguata formazione di sfere dell'epidermide. L'aggregazione densa a forma di sfera era considerata un segno distintivo della formazione spontanea di sferoidi.
È stato necessario utilizzare più di due volte 10 alle quattro cellule per garantire una corretta aggregazione spontanea. La piantagione di sfere dell'epidermide in coltura 2D ha portato alla proliferazione di un cheratinociti umano normale vitale di piccole dimensioni. È importante mantenere queste colture al di sotto della confluenza del 100% in quanto ciò può compromettere considerevolmente la loro crescita e lo stato delle cellule staminali in coltura.
Il processo di formazione di sferoidi epidermici è stato monitorato funzionalmente a livello di singola cellula da cellule trasfettate con un reporter fluorescente. La sottopopolazione di cheratinociti umani normali derivati da sferoidi è integrina alfa sei alta e EGF sono cellule basse. Le cellule costituiscono generalmente circa il 25% delle colture.
La caratterizzazione di questa sottopopolazione di cheratinociti simili a steli è stata ottenuta mediante analisi immunostaining della citocheratina basale 14 e della proteina tumorale 63. Il test di replating sferoide è una strategia efficace per l'arricchimento delle cellule staminali epidermiche dalla pelle umana neonatale. Questo sistema può essere impiegato come modello cellulare ad alto rendimento per studiare le malattie cutanee come la guarigione delle ferite e il cancro.
