Ce protocole présente une nouvelle méthode pour la culture et le maintien de cultures de sphères épidermiques, et la stratégie pour les étudier de près à l’aide du test de replaquage sphéroïde. Commencez par préparer le support de lavage tel que décrit dans le manuscrit du texte. Dans une hotte à écoulement laminaire, lavez le prépuce néonatal deux fois avec cinq millilitres de média de lavage dans un tube conique de cinq millilitres, puis transférez le prépuce lavé dans une boîte de Petri stérile.
À l’aide d’un scalpel et d’une pince, grattez le tissu adipeux et les tissus conjonctifs lâches de la couche dermique, puis lavez à nouveau le prépuce avec un produit de lavage. Placez l’épiderme du prépuce vers le haut dans une plaque de six puits contenant deux millilitres d’enzyme Dispase dilués dans un milieu de lavage. Transférer la plaque dans un incubateur pendant quatre heures.
Après l’incubation, transférer le prépuce dans une boîte de Pétri et utiliser une pince à pointe fine pour séparer l’épiderme de la couche du derme. Placez l’épiderme dans un tube conique de 15 millilitres contenant deux millilitres de 0,25% de trypsine-EDTA. Écrasez l’épiderme flottant à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et incuubez-le pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius avec un vortex périodique pendant cinq secondes toutes les cinq minutes.
Après l’incubation, ajouter deux millilitres d’inhibiteur de la trypsine de soja et mélanger par pipetage pour neutraliser la trypsine, puis centrifuger la suspension cellulaire. Resuspendez la pastille dans 12 millilitres de milieu KSFM-SCM complet et plaquez les cellules dans un plat de 10 centimètres pour incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez le fluide à l’aide d’une pipette aspirante et remplacez-le par 12 millilitres de KSFM-SCM complet.
Répétez cette opération les quatrième et septième jours. Préparer un mélange d’agarose à 5 % en ajoutant 2,5 grammes d’agarose à 50 millilitres de PBS dans une bouteille en verre de 100 millilitres. Autoclavez la bouteille sur le cycle liquide et laissez-la refroidir à température ambiante.
Pour préparer les plaques, placez le verre refroidi contenant une solution d’agarose dans un bécher d’un litre rempli de 200 millilitres d’eau désionisée. Faire fondre le mélange d’agarose dans un micro-ondes de qualité recherche pendant deux minutes, en mélangeant l’agarose toutes les 60 secondes en inclinant doucement la bouteille d’un côté à l’autre. Ajouter trois millilitres d’agarose fondue à 5 % à 12 millilitres de KSFM-SCM préwarmé à 42 degrés Celsius pour obtenir une concentration finale de 1 % d’agarose.
Ajouter 200 microlitres du mélange de gélose à 1 % à chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’un pipetter multicanal. Ensuite, laissez la plaque dans un environnement stérile à 25 degrés Celsius pendant quatre heures. Passage des kératinocytes humains normaux formant des sphéroïdes en aspirant des milieux et en lavant les cellules dans deux millilitres de PBS.
Aspirer le PBS et ajouter deux millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA aux cellules lavées. Ensuite, incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez deux millilitres d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et lavez les cellules de la plaque dans un tube de 15 millilitres.
Centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes. Resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS et quantifiez les cellules en utilisant la coloration Trypan Blue. Aliquote 20 000 kératinocytes humains normaux dans 100 microlitres de KSFM-SCM et ensemencer les cellules dans chaque puits de la plaque de 96 puits préalablement préparée.
Ensuite, incubez l’assiette pendant la nuit. À l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée, analysez les puits ensemencés pour la formation de sphères d’épiderme. 24 à 48 heures après la formation de la sphère de l’épiderme 3D, ajoutez quatre millilitres de KSFM-SCM préwargé à 37 degrés Celsius à un plat de six centimètres.
À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre à large alésage, transférez un seul sphéroïde sur la plaque et incubez la plaque pendant la nuit. Analysez le sphéroïde ensemencé pour attacher ou propager des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé. Cellules d’alimentation toutes les 96 heures en retirant le média et en ajoutant deux millilitres de milieu KSFM-SCM frais à l’assiette.
Passage de 70 à 80% de kératinocytes humains normaux dérivés de sphéroïdes confluents et de cultures monocouches 2D, comme démontré précédemment. Ensuite, quantifiez la viabilité des cellules à l’aide de Trypan Blue et d’un compteur de cellules automatisé. Aliquote 100 microlitres contenant 100 000 à 4 millions de kératinocytes humains normaux dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Placez les tubes sur la glace dans un environnement sombre en éteignant les lumières vives dans la hotte laminaire. Ajouter deux microlitres d’anti-intégrine alpha six conjuguée FITC et deux microlitres d’anti-EGFR conjugué PE aux tubes pour obtenir une dilution de un à 50. Préparez un tube sans anticorps ajouté pour servir de contrôle non coloré.
Incuber les tubes sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 minutes. Effectuer une analyse de cytométrie en flux avec des lasers appropriés. Utilisez les contrôles négatifs et positifs pour établir des portes.
Trier la sous-population de la fraction de cellules souches épidermiques, la fraction de cellules progénitives prolifératives et la fraction de cellules progénitives engagées. Tester la capacité proliférative des sous-populations cellulaires triées en transférant le contenu de chaque tube de tri respectif dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 fois le volume des cellules triées dans PBS. Centrifugez les tubes à 250 fois G pendant cinq minutes.
Retirez le surnageant et ressuspendez la pastille dans quatre millilitres de KSFM-SCM. Transférer les cellules ressuspendées dans une plaque de six centimètres et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone avec 95% d’humidité. Le lendemain, retirez le support des plaques et ajoutez quatre millilitres de KSFM-SCM préwargé à 37 degrés Celsius tous les trois jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte de 70 à 80%.
La capacité autonome de formation de sphéroïdes épidermiques des kératinocytes humains normaux en culture 3D a été évaluée à l’aide du test de la sphère de l’épiderme cutané. L’agrégation cellulaire non sphérique n’a pas été considérée comme une formation adéquate de la sphère de l’épiderme. L’agrégation dense en forme de sphère était considérée comme une caractéristique de la formation spontanée de sphéroïdes.
Il était nécessaire d’utiliser plus de deux fois 10 des quatre cellules pour assurer une bonne agrégation spontanée. La plantation de sphères d’épiderme en culture 2D a entraîné la prolifération de kératinocytes humains normaux viables de petite taille. Il est important de maintenir ces cultures en dessous de 100% de confluence, car cela peut considérablement nuire à leur croissance et à leur état de cellules souches en culture.
Le processus de formation de sphéroïdes épidermiques a été suivi fonctionnellement au niveau de la cellule unique par des cellules transfectées avec un rapporteur fluorescent. La sous-population de kératinocytes humains normaux dérivés de sphéroïdes est l’intégrine alpha six élevée et l’EGF sont des cellules faibles. Les cellules représentent généralement environ 25% des cultures.
La caractérisation de cette sous-population de kératinocytes en forme de tige a été obtenue par analyse immunocolorante de la cytokératine basale 14 et de la protéine tumorale 63. Le test de replaquage sphéroïde est une stratégie efficace pour l’enrichissement des cellules souches épidermiques de la peau humaine néonatale. Ce système peut être utilisé comme modèle cellulaire à haut débit pour étudier les maladies cutanées telles que la cicatrisation des plaies et le cancer.
