このプロトコルは、表皮球培養の培養と維持のための新しい方法と、スフェロイド再めっきアッセイを用いてそれらを綿密に調査する戦略を提示する。まず、テキスト原稿に記載されている洗剤を準備します。ラミナーフローフードで、新生児包皮を5ミリリットルの円錐状チューブで5ミリリットルの洗浄媒体で2回洗浄し、洗浄した包皮を滅菌ペトリ皿に移します。
メスと鉗子を使用して、脂肪組織を掻き取り、真皮層から緩い結合組織を削り取り、包皮を洗浄媒体で再洗浄する。包皮表皮側を、洗浄媒体で希釈した2ミリリットルのディスパス酵素を含む6ウェルプレートに上に置きます。プレートをインキュベーターに4時間移します。
インキュベーション後、包皮をペトリ皿に移し、細かい先端鉗子を使用して表皮を真皮層から分離する。0.25%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐状のチューブに表皮を入れる。5ミリリットルの血清ピペットを使用して浮遊表皮を粉砕し、5分ごとに5秒間周期的な渦を定めて摂氏37度で15分間インキュベートします。
インキュベーション後、2ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤を加え、ピペット処理してトリプシンを中和し、細胞懸濁液を遠心分離して混合する。完全なKSFM-SCM培地の12ミリリットルにペレットを再懸濁し、セルを10センチメートル皿にプレートし、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、吸引ピペットを使用して培地を取り出し、完全なKSFM-SCMの12ミリリットルに交換してください。
4日目と7日目にこれを繰り返します。100ミリリットルのガラス瓶に50ミリリットルのPBSに2.5グラムのアガロースを加えて5%アガロース混合物を調製する。ボトルを液体サイクルにオートクレーブし、室温まで冷却させます。
プレートを準備するには、200ミリリットルの脱イオン水を充填した1リットルのビーカーにアガロース溶液を含む冷却ガラスを入れます。研究用マイクロ波でアガロース混合物を最大2分間溶かし、ボトルを左右に軽く傾けて60秒ごとにアガロースを混合します。溶かした5%アガロースの3ミリリットルを摂氏42度で12ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMに加え、1%アガロースの最終濃度を得る。
マルチチャンネルピペッタを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに1%寒天ミックスの200マイクロリットルを追加します。その後、4時間摂氏25度で無菌環境にプレートを残します。パスススフェロイド形成正常ヒト角化細胞は、PBSの2ミリリットルで媒体および洗浄細胞を吸引する。
PBSを吸引し、洗浄した細胞に0.25%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを加える。その後、摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤をプレートに加え、プレートから15ミリリットルのチューブに細胞を洗浄します。
250回Gで5分間遠心分離機。PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー染色を使用して細胞を定量化する。アリコート20,000正常ヒトケラチノサイトは100マイクロリットルのKSFM-SCMで、前に調製した96ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種する。
その後、プレートを一晩インキュベートします。逆相対照顕微鏡を使用して、シードされたウェルを表皮球形成のために分析します。3D表皮球形成から24~48時間後、摂氏37度で4ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMを6センチメートルの皿に加える。
広いボア1ミリリットルピペットチップを使用して、プレートに単一のスフェロイドを転送し、一晩プレートをインキュベートします。反転相コントラスト顕微鏡を使用して、細胞を結合または伝播するためのシードされたスフェロイドを分析します。培地を取り出し、新鮮なKSFM-SCM培地を2ミリリットルずつプレートに添加することで、96時間ごとに細胞を供給します。
従来に示したように、70〜80%コンフルエントスフェロイド由来正常ヒトケラチノサイトおよび2D単層培養物を通過する。次に、Trypan Blueと自動セルカウンターを使用して細胞の生存率を定量化します。アリコート100マイクロリットルは、100、000〜400万個の正常なヒトケラチノサイトを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに含む。
薄層フード内の明るいライトをオフにして、暗い環境で氷の上にチューブを置きます。FITCコンジュゲート抗インテグリンα6と2マイクロリットルのPE結合抗EGFRをチューブに2マイクロリットル加えて、1~50希釈を達成します。未染色制御として機能する抗体を添加しないチューブを準備します。
暗闇の中で氷の上のチューブを30分間インキュベートします。適切なレーザーでフローサイトメトリー解析を行います。負と正のコントロールを使用して、ゲートを確立します。
表皮幹細胞画分の亜集団を並べ替え、増殖前駆細胞画分、及びプロゲニター細胞画分をコミットした。PBS内の細胞の10倍の体積を含む15ミリリットルの円錐管に各並べ替えチューブの含有量を移すことによって、細胞亜集団の増殖能力を試験する。チューブを250回Gで5分間遠心分離する。
上清を取り除き、KSFM-SCMの4ミリリットルでペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞を6センチメートルのプレートに移し、湿度95%の5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、プレートから培地を取り出し、70~80%の合流度に達するまで3日に37度で4ミリリットルのプリウォームKSFM-SCMを加えます。
3D培養における正常ヒトケラチノサイトの自律表皮スフェロイド形成能は、皮膚表皮球アッセイを用いて評価した。非球状細胞凝集は、十分な表皮球形成とは考えられてはいなかった。緻密な球状の凝集は、自発的な回転楕円体形成の特徴と考えられた。
適切な自発的な凝集を確実にするために、4つの細胞に2倍以上の10を使用する必要がありました。2D培養における表皮球の植え付けは、小さな生き生きとした正常なヒト角化細胞の増殖をもたらした。これらの培養物は、培養中の増殖や幹細胞状態を著しく損なう可能性がありますので、これらの培養物を100%以下に保つ必要があります。
表皮スフェロイド形成の過程を、蛍光レポーターを用いたトランスフェクト細胞により、単一細胞レベルで機能的に追跡した。スフェロイド由来正常ヒト角化細胞は、インテグリンα6高、EGFは低い細胞である。細胞は一般的に約25%の培養を構成する。
このステム様ケラチノサイト亜集団の特徴は、基底サイトケラチン14および腫瘍タンパク質63の免疫染色解析によって達成された。スフェロイド再めっきアッセイは、新生児ヒト皮膚からの表皮幹細胞の濃縮に有効な戦略です。このシステムは、創傷治癒や癌などの皮疾患を調査するハイスループット細胞系モデルとして採用することができる。
