使用来自同一物种的抗体进行双标记免疫荧光研究宿主 - 病原体相互作用

在该协议中，来自同一宿主的两种抗体可以在免疫荧光测定中一起使用，以研究宿主细胞和病原体的相互作用。由于只有少数商业抗体可用于识别寄生虫中的特定细胞结构和蛋白质，因此该协议可能非常有用。这是一种易于执行的双标记免疫荧光方案，使用在同一物种中培养的多克隆和单克隆抗体。

许多研究人员可能没有意识到这是可能的。当抗体来源有限时，这种方法会有所帮助。它可用于检测受感染宿主细胞中宿主细胞蛋白中的病原体，也可用于游离生物体。

这是一个简单的方案，需要在第一对和第二对抗体之间进行一个阻断步骤。该程序将由我实验室的Camila Gachet-Castro博士和博士生Lays Trajano-Silva演示。用克氏锥虫感染LLC-MK2细胞三天后，将感染细胞的上清液收集在15毫升细胞培养锥形管中。

离心样品以降低细胞碎片，然后将试管置于室温下，以使锥孢子虫游到上清液中。10分钟后，将上清液收集在新的锥形管中，然后离心样品并丢弃上清液，然后将含有寄生虫的沉淀重悬在完整的RPMI培养基中。将LLC-MK2细胞加入含有紫外线灭菌圆形盖玻片的24孔板中，并允许&m沉降16小时。

然后感染细胞，向每个孔中加入含有T.Cruzi的上清液并孵育六小时。接下来，用PBS洗涤含有受感染和未感染细胞的盖玻片五次，然后用PBS中的2%多聚甲醛固定细胞。10分钟后，用PBS清洗盖玻片三次，每次五分钟，然后用非离子洗涤剂使盖玻片透化10分钟。

在三次五分钟的PBS洗涤后，将盖玻片在封闭溶液中孵育30分钟，然后用小鼠单克隆或多克隆抗体再孵育30分钟。PBS洗涤后，用封闭溶液中的二抗和鬼臼素孵育盖玻片30分钟，以染色宿主细胞中的肌动蛋白丝。然后用PBS再次洗涤盖玻片三次，然后将少量带有DAPI培养基的防褪色安装试剂施加到载玻片表面。

使用镊子轻轻倾斜介质中的盖玻片，以防止形成气泡。对于双重标记，如前所述，在封闭溶液中孵育盖玻片后，将它们在小鼠多克隆抗体中孵育30分钟。接下来，用PBS洗涤盖玻片三次，每次五分钟，然后用二抗孵育30分钟。

然后在三次PBS洗涤后，用在封闭溶液中稀释的AffiniPure兔抗小鼠IgG进行第二次阻断步骤。30分钟后，再次用PBS洗涤盖玻片，然后用小鼠单克隆抗体再孵育30分钟。接下来，在三次 PBS 洗涤后，用山羊抗小鼠 IgG 2B 抗体和苷孵育盖玻片。

然后在三次PBS洗涤后，应用防褪色安装试剂，如前所述。对于三重标记，在封闭盖玻片并与小鼠多克隆抗体孵育后，接着是山羊抗小鼠抗体，在封闭溶液中开始与兔多克隆抗体进行新的孵育30分钟。然后在三次PBS洗涤后，用山羊抗兔抗体孵育盖玻片30分钟。

接下来，在三次PBS洗涤后，用在封闭溶液中稀释的AffiniPure兔抗小鼠抗体进行阻断步骤30分钟。然后再次洗涤盖玻片，然后与任何小鼠单克隆IgG亚类抗体孵育30分钟。在三次PBS洗涤后，用一对特定的山羊抗小鼠IgG亚类抗体孵育盖玻片30分钟。

孵育后，用PBS清洗盖玻片三次，每次五分钟。使用带有63X油浸物镜的共聚焦显微镜分析免疫荧光样品，并使用光电倍增管和混合检测器检测荧光。然后，使用单独的通道采集所有共聚焦图像，并使用 Adobe Photoshop 执行图像处理。

这些共聚焦显微镜图像显示了受感染和未感染细胞的对照实验的结果，突出了宿主细胞中抗体和内化寄生虫的特异性。小鼠多克隆抗体抗克氏锥虫FAZ在寄生虫鞭毛的鞭毛附着区识别出T.cruzi巨蛋白，但在宿主细胞中没有。使用商业小鼠单克隆抗体观察细胞核中异质性核糖核蛋白A1的分布，该抗体仅识别宿主哺乳动物细胞，而不识别寄生虫。

此外，用 DAPI 染色宿主和寄生虫细胞核以及寄生虫动力学体，并用与 Alexa 594 偶联的蛋白染色宿主 F - 肌动蛋白，证实了抗体的特异性。双标记免疫荧光显示受试者体内的蛋白质分布和通过共聚焦显微镜分析的寄生虫。标记表明使用这种方法的抗体之间没有交叉反应。

总之，这里描述的用于研究宿主 - 病原体相互作用的方案提出了一种基本且复杂的技术，可以适应任何抗体组合。这种方法使免疫荧光具有成本效益，并且当抗体很少可用时，可以帮助研究两种或多种感兴趣蛋白质的定位。