斑马鱼神经母细胞瘤转移模型

这些方法用于开发第一个斑马鱼神经母细胞瘤转移模型。并证明该模型可以忠实地概括在神经母细胞瘤高风险患者中看到的许多转移特征。这种转移性斑马鱼模型的主要优点是肿瘤扩散的实时体内成像，以更好地了解何时以及如何发生转移。

这种技术并不特定于神经母细胞瘤。它可以应用于各种类型癌症的斑马鱼模型，只要可以识别和跟踪肿瘤细胞，从而产生一系列可能性。首先，通过杂交MYCN和LMO1转基因品系，开发一个杂合转基因鱼系，过度表达MYCN和LMO1。

在受精后一天，使用立体荧光显微镜对外杂交的后代进行分类，以进行EGFP表达，其表现为EGFP阳性点。分拣后，将筛选的胚胎分离到单独的培养皿中，并将培养皿标记为MYCN阳性或MYCN阴性。在受精后三到四天对两组的胚胎进行可视化和分类，以获得LMO1表达。

在上颈神经节和非PSNS多巴胺能神经元细胞中寻找红色荧光斑点，特别是在后脑的长叶髓质中。在胚胎受精后五天进行筛查。然后将分类的鱼分离成四组不同的基因型，并标记为仅MYCN，仅LMO1，MYCN和LMO1以及野生类型。

根据标准协议在相同的条件下饲养它们。用立体荧光显微镜观察肿瘤，用两侧的金属刮刀轻轻翻转鱼来观察肿瘤。在鉴定出可能的携带肿瘤的鱼后，将它们分离到单独的水箱中，并带有适当的标签，包括出生日期，肿瘤筛查日期和基因型。

在受精后六周，重复先前的步骤以筛查含肿瘤鱼和非肿瘤鱼，以确认先前筛查过的鱼是否存在肿瘤或识别新的可能的含瘤鱼。寻找荧光阳性肿块和确诊的含瘤鱼的持续或增加的大小。在识别出含肿瘤的鱼后，每两周监测一次它们以寻找肿瘤细胞迁移的证据，其表现为远离肿瘤发生原发部位的微小EGFP或mCherry阳性肿瘤肿块。

根据需要将这些鱼隔离到单独的水箱中，并适当标记以指示可能的转移。在解释LMO1鱼中的杂合性MYCN并对其后代进行分类后，EGFP MYCN表达在受精后一天在非PSNS多巴胺能神经元细胞中显着。相比之下，LMO1表达在PSNS细胞和非PSNS多巴胺能神经元细胞中都很突出。

在具有MYCN和LMO1过表达的复合转基因鱼中，远离原发肿瘤部位的器官组织中检测到荧光阳性肿瘤肿块，但在仅表达MYCN的转基因鱼中未检测到。手术部分的H&E染色表明，原发性肿瘤起源于腺间区域，斑马鱼相当于人类肾上腺，这是神经母细胞瘤患者最常见的原发性疾病部位。在多个区域检测到远离腺间的肿瘤肿块，包括肾脏的远端部分，眼眶，鳃，脾脏和心脏心房的内壁。

确认了原发肿瘤和所有转移部位的肿瘤细胞的PSNS神经母细胞谱系。与单独表达MYCN的肿瘤相比，在MYCN LMO1肿瘤中发现PSR染色的胶原纤维的显着扩增量和增加的厚度。使用该程序后，可以应用药物筛选和测试新的癌症疗法，这可能导致开发替代药物来预防和治疗转移性癌症。