Questi metodi sono stati utilizzati per sviluppare il primo modello di zebrafish di metastasi del neuroblastoma. E per dimostrare che questo modello può ricapitolare fedelmente molte caratteristiche delle metastasi osservate in pazienti ad alto rischio di neuroblastoma. Il vantaggio principale di questo modello metastatico di zebrafish è l'imaging in vivo in tempo reale della diffusione del tumore per capire meglio quando e possibilmente come si verificano le metastasi.
Questa tecnica non è specifica per il neuroblastoma. Può essere applicato a modelli di zebrafish di diversi tipi di tumori purché le cellule tumorali possano essere identificate e tracciate portando a una serie di possibilità. Per iniziare, sviluppare una linea di pesce transgenica eterozigote che sovraesprima sia MYCN che LMO1 incrociando linee transgeniche MYCN e LMO1.
Ad un giorno dopo la fecondazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza stereoscopica per ordinare la progenie di outcross per l'espressione EGFP, che si presenta come punti positivi EGFP. Dopo la cernita, isolare gli embrioni sottoposti a screening in piastre di Petri separate ed etichettare le piastre come MYCN positive o MYCN negative. Visualizza e ordina gli embrioni di entrambi i gruppi per l'espressione di LMO1 da tre a quattro giorni dopo la fecondazione.
Cerca macchie di fluorescenza rossa sia nel ganglio cervicale superiore che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS, specialmente nel midollo allungato del cervello posteriore. Eseguire lo screening prima che gli embrioni raggiungano i cinque giorni dopo la fecondazione. Quindi isolare i pesci ordinati in quattro gruppi di genotipi diversi ed etichettare come solo MYCN, solo LMO1, MYCN e LMO1 entrambi e wild type.
Allevarli in condizioni identiche secondo i protocolli standard. Visualizza i tumori con un microscopio a fluorescenza stereoscopica capovolgendo delicatamente il pesce con una spatola metallica su entrambi i lati laterali per visualizzare il tumore. Dopo l'identificazione dei possibili pesci portatori di tumore, isolarli in un serbatoio separato con etichette appropriate che includono la data di nascita, la data in cui il tumore è stato sottoposto a screening e il genotipo.
A sei settimane dopo la fecondazione, ripetere i passaggi precedenti per lo screening dei pesci portatori di tumore e dei pesci non portatori di tumore per confermare la presenza di tumori per pesci precedentemente sottoposti a screening o identificare nuovi possibili pesci portatori di tumore. Cerca le dimensioni sostenute o aumentate della massa positiva alla fluorescenza e dei pesci portatori di tumore confermati. Dopo aver identificato i pesci portatori di tumore, monitorarli due volte alla settimana per l'evidenza della migrazione delle cellule tumorali, che si presenta come minuscole masse tumorali EGFP o mCherry positive lontano dal sito primario di genesi del tumore.
Isolare questi pesci in vasche separate secondo necessità ed etichettare in modo appropriato per indicare possibili metastasi. Dopo aver interpretato il MYCN eterozigote nei pesci LMO1 e durante l'ordinamento della loro progenie, l'espressione di EGFP MYCN era prominente nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS in un giorno dopo la fecondazione. Al contrario, l'espressione di LMO1 era prominente sia nelle cellule PSNS che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS.
Masse tumorali fluorescenti positive sono state rilevate nei tessuti degli organi, distanti dal sito tumorale primario nel pesce transgenico composto con sovraespressione sia di MYCN che di LMO1, ma non nel pesce transgenico con la sola espressione di MYCN. La colorazione H & E delle sezioni chirurgiche mostra che il tumore primario è sorto dalla regione della ghiandola interrenale, l'equivalente zebrafish della ghiandola surrenale umana che è il sito più comune di malattia primaria nel paziente con neuroblastoma. Masse tumorali distanti dalla ghiandola interrenale sono state rilevate in più regioni, tra cui la porzione distale del rene, l'orbita, la branchia, la milza e la parete interna della camera atriale del cuore.
Il lignaggio dei neuroblasti PSNS delle cellule tumorali nel tumore primario e in tutti i siti metastatici è stato confermato. Quantità significativamente amplificate e aumento dello spessore delle fibre di collagene colorate con PSR sono state trovate nei tumori MYCN LMO1 rispetto ai tumori che esprimono mycn da solo. Dopo aver utilizzato questa procedura, è possibile applicare lo screening farmacologico e testare nuove terapie antitumorali, che possono potenzialmente portare allo sviluppo di agenti alternativi per prevenire e curare i tumori metastatici.
