Эти методы были использованы для разработки первой модели метастазирования нейробластомы рыбок данио. И продемонстрировать, что эта модель может точно повторить многие особенности метастазирования, наблюдаемые у пациентов с высоким риском развития нейробластомы. Основным преимуществом этой метастатической модели рыбок данио является визуализация диссеминации опухоли в режиме реального времени in vivo, чтобы лучше понять, когда и, возможно, как происходит метастазирование.
Этот метод не является специфическим для нейробластомы. Он может быть применен к моделям рыбок данио различных видов рака, если опухолевые клетки могут быть идентифицированы и отслежены, что приводит к множеству возможностей. Для начала разработайте гетерозиготную трансгенную рыбью линию, чрезмерно экспрессирующую как MYCN, так и LMO1 путем скрещивания трансгенных линий MYCN и LMO1.
В один день после оплодотворения используйте стереоскопический флуоресцентный микроскоп, чтобы отсортировать потомство ауткросса для экспрессии EGFP, которая представляет собой положительные точки EGFP. После сортировки изолируйте просоченные эмбрионы в отдельные чашки Петри и пометьте чашки как MYCN положительные или MYCN отрицательные. Визуализируйте и сортируйте эмбрионы обеих групп для экспрессии LMO1 через три-четыре дня после оплодотворения.
Ищите красные флуоресцентные пятна как в верхнем шейном ганглии, так и в не-PSNS дофаминергических нейронных клетках, особенно в продолговатом мозге заднего мозга. Проведите скрининг до того, как эмбрионы достигнут пяти дней после оплодотворения. Затем выделите отсортированную рыбу на четыре группы различных генотипов и пометьте только MYCN, только LMO1, MYCN и LMO1 и дикий тип.
Поднимайте их в одинаковых условиях по стандартным протоколам. Визуализируйте опухоли с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, осторожно переворачивая рыб металлическим шпателем с обеих боковых сторон, чтобы увидеть опухоль. После идентификации возможных опухоленосных рыб выделите их в отдельный резервуар с соответствующими метками, которые включают дату рождения, дату скрининга опухоли и генотип.
Через шесть недель после оплодотворения повторите предыдущие шаги для скрининга на опухоленосных рыб и рыб, не неоносных, чтобы подтвердить наличие опухолей для ранее проверенных рыб или выявить новых возможных опухоленосных рыб. Ищите устойчивый или увеличенный размер флуоресцентной положительной массы и подтвержденных опухоленосных рыб. После выявления опухоленосных рыб два раза в неделю контролируйте их за доказательствами миграции опухолевых клеток, которая представляет собой крошечные EGFP или mCherry положительные опухолевые массы, удаленные от первичного места генеза опухоли.
Выделите этих рыб в отдельные резервуары по мере необходимости и нанесите соответствующую маркировку, чтобы указать на возможные метастазы. После интерпретации гетерозиготного MYCN у рыб LMO1 и при сортировке их потомства экспрессия EGFP MYCN была заметна в дофаминергических нейрональных клетках без PSNS в один день после оплодотворения. Напротив, экспрессия LMO1 была заметна как в клетках PSNS, так и в не-PSNS дофаминергических нейрональных клетках.
Флуоресцентные положительные опухолевые массы были обнаружены в тканях органов, удаленных от первичного участка опухоли у сложных трансгенных рыб с гиперэкспрессией как MYCN, так и LMO1, но не у трансгенных рыб с экспрессией только MYCN. Окрашивание H & E хирургических участков показывает, что первичная опухоль возникла из области межпочечной железы, эквивалента рыбки данио надпочечников человека, которая является наиболее распространенным местом первичного заболевания у пациентов с нейробластомой. Опухолевые массы, удаленные от межпочечной железы, были обнаружены в нескольких областях, включая дистальную часть почки, орбиту, жабры, селезенку и внутреннюю стенку предсердной камеры сердца.
Подтверждена линия нейробластов PSNS опухолевых клеток при первичной опухоли и всех метастатических участках. Значительно увеличенные количества и увеличенная толщина окрашенных PSR коллагеновых волокон были обнаружены в опухолях MYCN LMO1 по сравнению с опухолями, экспрессирующими только MYCN. После использования этой процедуры может быть применен скрининг лекарств и тестирование новых методов лечения рака, что потенциально может привести к разработке альтернативных агентов для профилактики и лечения метастатического рака.
