转变生长因子的分析 - 家族产品分泌到 异种胚胎 的爆炸

此协议可用于研究在蛋白质裂解后将更广泛的分离前体蛋白（包括 TGF-beta 家庭成员）转化为活性蛋白质的过程。此协议的主要优点是，它提供了非常快速和廉价的方法，以获得高度浓缩的 TGF - β产品在体内可视化条件下。首先，在第二天注射后，取出Ficoll溶液和任何死亡或垂死的胚胎，然后用MBS冲洗胚胎一两次，并在室温下或在16摄氏度的培养器中将MBS中的胚胎培养在长凳上，以减缓发育。

使用具有所需设置的微管拉拔器加热和拉玻璃毛细血管到精细点。使用钳子，从拔针尖上剪下来。为了防止堵塞，爆破吸入针的开口应大于微喷针。

将吸入针插入连接到微喷射器的针架中，并将针架连接到微操纵器上。将早期到中期胃肠阶段胚胎放到充满 MBS 的注射托盘或盘中。将针头插入动物杆附近的胚胎表面下方。

通过解剖显微镜观察针头和胚胎时，按微喷管上的填充按钮。几秒钟后，针头的透明液体水平上升，胚胎崩溃并凹陷。脉冲注射按钮一次或多次，以弹出任何多云的白色物质进入针含有碎片或蛋白酶。

要检测免疫腹胀上的产品，根据抗体，吸气 10 至 20 个或以上的胚胎的胚泡液。将一微升无核水撒在注射托盘上的石蜡片上。将针头浸入水中，按下注射按钮，将爆破液排入水中。

或者，要将液体直接喷射到副膜上并防止其变平，则脉冲注射按钮，以在较低压力下排出液体。将收获的爆破液转移到冰上无菌微中心管中，并加入无核水，将最终体积调整为 30 微升。为了检测TGF-beta前体蛋白，将爆炸性液体耗尽的胚胎转移到冰上单独的管子中。

去除多余的 MBS，并添加 200 微升预冷冻胚胎裂解缓冲器。要使胚胎完全同质化，移液器上下10至20次，直到没有团块存在。将同质化胚胎以1万倍G为10000G的冷藏微中心中离心10分钟，然后用P200移液器取出160微升超分子，并转移到冰上的新管子上，小心避免管下半部分的白蛋黄蛋白和其他细胞碎片。

重复一次微中心计算，将128微升的透明超高超高音调剂转移到冰上的新管子上。此时，清除的胚胎解解液和收集的胚泡液可以储存在零下80摄氏度，只要需要。通过使用 PNGase F 通过跨戈尔吉网络修改的爆破液中的裂解蛋白脱脂，并遵循制造商的说明。

去糖基化产品将迁移为 SDS 凝胶上更浓缩的带，这有助于准确识别。为了评估在胚泡和裂解物中的前列腺素片段单体和展开的蛋白质，通过在减少条件下添加5个微升，将4倍样品缓冲液添加到15个微光体爆破细胞液和15个澄清胚胎裂解物微升体中来分析蛋白质。为了评估裂开的同质或异质配体在爆破细胞中的形成，通过在其余15个微升的爆破液中加入5个不减少的4倍样品缓冲的微升来分析非减少条件下的蛋白质，然后加热5分钟，将其放在冰上。

使用此协议后，蛋白质被SDS-PAGE分离，免疫膨胀物被探测到识别myc表位标签的抗体。在减少条件下，在只表达Bmp4或Bmp7的胚胎的裂解物中，检测到与裂开的Bmp4单体对应的单个带和与裂开的Bmp7单体对应的较慢的迁移带。这两个带子在共同表达Bmp4和Bmp7的胚胎中被检测到。

当蛋白质在非减少条件下分离时，在胚胎中检测到单个成熟的Bmp4和7个中间移动的异质体带，以及共同表达Bmp4和Bmp7的微量Bmp4同质体。 当Bmp7蛋白质水平高时，也观察到Bmp4和Bmp7异质体的形成。然而，在这种情况下，多余的Bmp7形成了同质体和胚胎共同表达Bmp4和Bmp7。

这些结果表明，Bmp4和7在异种胚胎中共同表达时优先形成异质体。在这个实验中，收集纯爆破球菌是需要精确针头处理经验的最重要步骤。所以，只要继续尝试和修复错误。

此过程测试 BMP 异质体是否形成，哪些氨基酸对此很重要。下一步，可以生成敲击鼠标，询问这些氨基酸在哺乳动物发育过程中是否具有重要功能。