成像 Dpp 释放从果蝇翼光盘

DPP 通过结合受体和在细胞内发送信号影响转录，影响细胞命运。如果 DPP 产生但未释放，则无法访问受体，因此无法执行其角色。这种技术使得能够可视化D DPP释放，使研究人员能够检查哪些遗传和环境因素改变了D DPP释放动态。

BMP信号通路从苍蝇到人类都得到保护，因此我们预计，决定 DPP 释放的机制也将与人类发展和再生相关。首先穿越 30 到 40 处女女性 Dpp GAL4 苍蝇与 10 到 15 雄 UAS DPP - GFP 苍蝇。在新鲜小瓶食物中加入少量酵母酱，鼓励产卵。

要收集鸡蛋，翻转交叉苍蝇到小瓶，并允许他们躺在三到四个小时，然后删除他们。将鸡蛋收集瓶保持在25摄氏度左右144小时，直到幼虫处于第三个星形阶段。然后选择适当的幼虫进行解剖。

首先，选择非结核的幼虫，这是正常长度，而不是短和脂肪。要选择表达幼虫的DP-GFP，请在荧光立体显微镜下观察它们。所有非结核幼虫都会有荧光，但GP仅限于翼盘，在DP-GFP幼虫上不太亮。

根据手稿指示准备经过修改的 HL3 介质，使翼盘保持活成像状态。使用 HEPES 将 pH 调整为 7.1，然后通过 0.22 微米过滤器进行过滤。将两块无色双面胶带宽度放在显微镜幻灯片上，在显微镜幻灯片之间留下大约 5 毫米的空间，并确保胶带的末端与幻灯片的边缘齐平。

使用平边将胶带牢固地压在幻灯片上。在两块磁带之间添加 25 个经过修改的 HL3 介质的微升。当翼盘安装在介质中时，胶带片将防止其被盖玻片压碎。

要解剖幼虫，请将幼虫放在经过修改的HL3介质中，用两对钳子轻轻撕成两半。丢弃后半部分，然后用一对钳子抓住前半部分的中间，然后用另一对将嘴钩推回幼虫，直到它完全倒置。寻找气管两个较深颜色的主要分支的尖锐弯曲，这些根分支沿着幼虫的两侧运行。

翼盘直接位于下方。轻轻取出光盘，并将其放在准备好的幻灯片上的 HL3 介质中，确保没有气管碎片仍然附着在光盘上。排列翼盘，使翼袋的四边朝上，圆盘平躺。

用盖玻片盖住机翼，用指甲油密封。抛光干燥后，立即进行成像。使用共和激光扫描显微镜使用 40 倍油目标和 488 纳米激光成像安装的翼盘。

以两赫兹的速度收集图像两分钟。为了获得最佳效果，请设置足够强大的激光功率，以获得 DPP 释放细胞的清晰图像，以避免过度漂白。收集图像作为时间序列，并导出为AVI文件，以获得 DPP 发布的视频。

当协议成功时，DPP-GFP 会以条纹出现，在翼盘的中心，核以非荧光圆可见。DPP-GFP 释放是可见的荧光朋塔，在细胞体中和远离细胞体中出现和消失。独特的pucta可能是在细胞或在细胞键突触。

安装翼盘，以便从四边一开始进行成像。如果翼盘从反面成像，DPP-GFP荧光将出现焦点，分辨率差。当GP不与民进党融合时，在细胞体之外没有观察到任何庞塔。

此控件表明 DPP-GFP 的行为与 GFP 本身的行为不同。此外，当不表达 DPP-GFP 时，不会出现荧光朋塔。在此过程期间，翼盘必须安装在上侧。

如果翼盘方向不当，DPP-GFP 将出现焦点。此方法可用于研究其他发育信号配体（如无翼或刺猪）的释放。我们可以探讨可能影响民进党释放的所有不同的环境和遗传因素。

此外，我们可以调整此方法来研究其他细胞类型的BMP释放。