Этот протокол может быть использован для изучения процесса, с помощью которого более широкий спектр сегрегированных белков-предшественников, включая членов семейства TGF-бета, превращается в активные белки после протеолитического расщепления. Основным преимуществом этого протокола является то, что он обеспечивает очень быстрые и недорогие методы получения высококонцентрированного продукта расщепления TGF-бета in vivo в визуализированном состоянии. Для начала после инъекции на следующий день удалите раствор Фиколла и любые мертвые или умирающие эмбрионы, затем промывайте эмбрионы один или два раза MBS и культивирование эмбрионов в MBS на скамейке при комнатной температуре или при 16 градусах Цельсия в инкубаторе, чтобы замедлить развитие.
Нагрейте и потяните стеклянные капилляры до тонкой точки с помощью съемника микропипетки с нужными настройками. С помощью щипцов отрежьте кончик вытянутой иглы. Для предотвращения засорения отверстие аспирационной иглы бластоцеле должно быть больше, чем у микроинъекционной иглы.
Вставьте аспирационную иглу в держатель иглы, подключенный к микроинжектору, и прикрепите держатель иглы к микроманипулятору. Поместите эмбрионы ранней и средней стадии гаструлы в заполненный MBS инъекционный лоток или блюдо. Вставьте иглу ниже поверхности эмбриона рядом с полюсом животного.
Нажмите кнопку заполнения на микроинжекторе, наблюдая за иглой и эмбрионом через рассекающий микроскоп. В течение нескольких секунд уровень прозрачной жидкости в игле повышается, и эмбрион разрушается и становится вогнутым. Нажмите кнопку инъекции один или несколько раз, чтобы извлечь любое мутное белое вещество, входя в иглу, содержащую мусор или протеазы.
Для обнаружения продуктов расщепления на иммуноблотах аспирируют бластоцелевую жидкость от 10 до 20 эмбрионов или более в зависимости от антител. Пипетка одним микролитом воды без ядра на кусок парафина, помещенный на инъекционный лоток. Погружайте иглу в каплю воды и нажмите кнопку впрыскивания, чтобы рассеять бластоцелевую жидкость в воду.
В качестве альтернативы, чтобы выбросить жидкость непосредственно на парапленку и предотвратить ее сглаживание, нажмите кнопку впрыскивания, чтобы вытеснить жидкость под более низким давлением. Перенесите собранную бластоцелевую жидкость в стерильную микроцентрифужную трубку на льду и добавьте воду без ядра, чтобы отрегулировать конечный объем до 30 микролитров. Чтобы обнаружить белки-предшественники TGF-бета, перенесите истощенные бластоцелейной жидкостью эмбрионы в отдельную трубку на льду.
Удалите избыток MBS и добавьте 200 микролитров предварительно охлажденного буфера лизата эмбриона. Чтобы полностью гомогенизировать эмбрионы, пипетку вверх и вниз от 10 до 20 раз, пока не останутся комки. Центрифугируют гомогенизированные эмбрионы в охлажденной микроцентрифуге при 10 000 G в течение 10 минут, затем удаляют 160 микролитров супернатанта с помощью пипетки P200 и переносят в новую трубку на льду, стараясь избегать белков белого желтка и другого клеточного мусора в нижней половине трубки.
Повторите микроцентрифугирование один раз и перенесите 128 микролитров прозрачного супернатанта в новую трубку на льду. В этот момент очищенные эмбриональные лизаты и собранная бластоцелевая жидкость могут храниться при минус 80 градусах Цельсия столько, сколько пожелает. Дегликозилировать расщепленные белки, присутствующие в бластоцелевой жидкости, модифицированные через транс-гольджи-сеть с помощью PNGase F, следуя инструкциям производителя.
Дегликозилированные продукты будут мигрировать в виде более конденсированной полосы на гелях SDS, что может помочь в точной идентификации. Для оценки мономеров продомендного фрагмента и развернутых белков в бластоцеле и лизате анализируют белки в условиях редуцирования путем добавления пяти микролитров восстанавливающего буфера образца 4X к 15 микролитрам бластоцелевой жидкости и 15 микролитрам осветленного эмбрионального лизата. Чтобы оценить образование расщепленных гомодимерных или гетеродимерных лигандов в бластоцеле, проанализируйте белки в условиях невосстановления, добавив пять микролитров невосстанавливающегося буфера образца 4X к оставшимся 15 микролитрам бластоцелевой жидкости, затем нагрейте его в течение пяти минут и поместите на лед.
После использования этого протокола белки были разделены SDS-PAGE, и иммуноблоты были исследованы антителами, которые распознавали метку эпитопа myc. В восстановительных условиях в лизатах эмбрионов, экспрессирующих только Bmp4 или Bmp7, была обнаружена одна полоса, соответствующая расщепленным мономерам Bmp4, и более медленная мигрирующая полоса, соответствующая расщепленным мономерам Bmp7. Обе полосы были обнаружены у эмбрионов, совместно экспрессифицировывающих Bmp4 и Bmp7.
Когда белки разделяли в нередукционных условиях, была обнаружена одна зрелая гетеродимерная полоса промежуточной подвижности Bmp4 и 7 вместе со следовым количеством гомодимера Bmp4 в эмбрионах, совместно экспрессифицировывающих Bmp4 и Bmp7. Образование гетеродимеров Bmp4 и Bmp7 также наблюдалось при высоких уровнях белка Bmp7. Однако в этом случае избыток Bmp7 образует гомодимеры, а эмбрионы совместно экспрессируют Bmp4 и Bmp7.
Эти результаты показали, что Bmp4 и 7 предпочтительно образуют гетеродимеры при совместной экспрессии в эмбрионах Xenopus laevis. В этом эксперименте сбор чистого бластоцеле является наиболее важным шагом, который требует точного опыта обращения с иглами. Так что просто продолжайте пытаться и исправлять ошибки.
Эта процедура проверяет, образуются ли гетеродимеры BMP и какие аминокислоты важны для этого. На следующем этапе можно сгенерировать мышь-нокин, чтобы спросить, являются ли эти аминокислоты функционально важными во время развития млекопитающих.
