Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il processo attraverso il quale una gamma più ampia di proteine precursori segregate, compresi i membri della famiglia TGF-beta, vengono convertite in proteine attive dopo scissione proteolitica. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce metodi molto rapidi ed economici per ottenere un prodotto di scissione TGF-beta altamente concentrato in vivo in condizioni visualizzate. Per cominciare, dopo l'iniezione il giorno seguente, rimuovere la soluzione di Ficoll e gli eventuali embrioni morti o morenti, quindi risciacquare gli embrioni una o due volte con MBS e colturare gli embrioni in MBS sul banco a temperatura ambiente o a 16 gradi Celsius nell'incubatrice per rallentare lo sviluppo.
Riscaldare e tirare i capillari di vetro in un punto fine usando un estrattore di micropipette con le impostazioni desiderate. Usando la pinna, tagliare la punta di un ago tirato. Per evitare l'intasamento, l'apertura dell'ago di aspirazione del blastocele deve essere più grande dell'ago per microiniezione.
Inserire l'ago di aspirazione nel supporto dell'ago collegato al microiniettore e collegare il supporto dell'ago al micromanipolatore. Posizionare gli embrioni in stadio di gastrula da precoce a metà in un vassoio o in un piatto di iniezione pieno di MBS. Inserire l'ago sotto la superficie dell'embrione vicino al palo animale.
Premere il pulsante di riempimento sul microiniettore mentre si osserva l'ago e l'embrione attraverso un microscopio di dissezione. In pochi secondi, il livello di liquido chiaro sale nell'ago e l'embrione collassa e diventa concavo. Pulsare il pulsante di iniezione una o più volte per espellere qualsiasi sostanza bianca torbida che entra nell'ago contenente detriti o proteasi.
Per rilevare i prodotti di scissione sugli immunoblot, aspirare il liquido blastocele da 10 a 20 embrioni o più a seconda degli anticorpi. Pipettare un microlitro di acqua priva di nucleo su un pezzo di paraffina posto sul vassoio di iniezione. Immergere l'ago nella goccia d'acqua e premere il pulsante di iniezione per dissipare il liquido di blastocele nell'acqua.
In alternativa, per espellere il fluido direttamente sul parafilm e impedirne l'appiattimento, pulsare il pulsante di iniezione per espellere il fluido a una pressione inferiore. Trasferire il liquido blastocele raccolto in un tubo microcentrifuga sterile su ghiaccio e aggiungere acqua priva di nucleo per regolare il volume finale a 30 microlitri. Per rilevare le proteine precursori del TGF-beta, trasferire gli embrioni impoveriti del liquido del blastocele in un tubo separato sul ghiaccio.
Rimuovere l'MBS in eccesso e aggiungere 200 microlitri di tampone di lisato embrionale pre-refrigerato. Per omogeneizzare completamente gli embrioni, pipettare su e giù da 10 a 20 volte fino a quando non rimangono grumi. Centrifugare gli embrioni omogeneizzati in una microcentrifuga refrigerata a 10.000 volte G per 10 minuti, quindi rimuovere 160 microlitri del surnatante utilizzando una pipetta P200 e trasferirli in un nuovo tubo su ghiaccio, facendo attenzione ad evitare le proteine del tuorlo bianco e altri detriti cellulari nella metà inferiore del tubo.
Ripetere la microcentrifugazione una volta e trasferire 128 microlitri del surnatante trasparente in un nuovo tubo su ghiaccio. A questo punto, i lasati embrionali eliminati e il liquido blastocele raccolto possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius per tutto il tempo desiderato. Deglicosilato le proteine scisse presenti nel liquido blastocele modificato attraverso la rete trans-Golgi con PNGasi F seguendo le istruzioni del produttore.
I prodotti deglicosilati migrerebbero come una banda più condensata sui gel SDS, il che può aiutare nell'identificazione accurata. Per valutare i monomeri del frammento di prodominio e le proteine dispiegate nel blastocele e nel lisato, analizzare le proteine in condizioni di riduzione aggiungendo cinque microlitri di riduzione del tampone del campione 4X a 15 microlitri di liquido blastocele microlitri e 15 microlitri di lisato embrionale chiarificato. Per valutare la formazione di ligandi omodimerici o eterodimerici scissi nel blastocele, analizzare le proteine in condizioni non riducenti aggiungendo cinque microlitri di tampone campione 4X non riducente ai restanti 15 microlitri di liquido blastocele, quindi riscaldarlo per cinque minuti e metterlo sul ghiaccio.
Dopo aver utilizzato questo protocollo, le proteine sono state separate da SDS-PAGE e gli immunoblot sono stati sondati con anticorpi che hanno riconosciuto il tag dell'epitopo mico. Nelle condizioni di riduzione, nei lisati da embrioni che esprimono solo Bmp4 o Bmp7, è stata rilevata una singola banda corrispondente a monomeri Bmp4 scissi e una banda migrante più lenta corrispondente ai monomeri Bmp7 scissi. Entrambe le bande sono state rilevate in embrioni co-espressivi Bmp4 e Bmp7.
Quando le proteine sono state separate in condizioni non riducenti, sono state rilevate una singola banda di mobilità intermedia Bmp4 matura e 7 eterodimero insieme a una traccia di omodimero Bmp4 negli embrioni co-espressivi Bmp4 e Bmp7. La formazione di eterodimero Bmp4 e Bmp7 è stata osservata anche quando i livelli di proteina Bmp7 erano elevati. Tuttavia, in questo caso, l'eccesso di Bmp7 formava omodimeri ed embrioni co-espressi Bmp4 e Bmp7.
Questi risultati hanno dimostrato che Bmp4 e 7 formano preferenzialmente eterodimeri quando co-espressi in embrioni di Xenopus laevis. In questo esperimento, la raccolta del blastocele puro è il passo più importante che richiede una precisa esperienza di manipolazione dell'ago. Quindi continua a provare e correggere gli errori.
Questa procedura verifica se si formano eterodimeri BMP e quali amminoacidi sono importanti per questo. Passo successivo, knockin mouse può essere generato per chiedere se questi aminoacidi sono funzionalmente importanti durante lo sviluppo dei mammiferi.
