이 프로토콜은 TGF-베타 가족 구성원을 포함하여 분리된 전구체 단백질의 넓은 범위가 프로테오리컬 분열 다음 활성 단백질로 변환되는 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 시각화 된 조건하에서 생체 내에서 고농축 TGF 베타 분열 제품을 얻기 위해 매우 빠르고 저렴한 방법을 제공한다는 것입니다. 우선, 다음 날 주사 후, Ficoll 용액과 사망 또는 죽어가는 배아를 제거한 다음 MBS로 한두 번 배아를 헹구고 실온에서 벤치에 있는 MBS의 배아를 실내 온도 또는 인큐베이터의 섭씨 16도에서 배양하여 개발을 늦추도록 합니다.
유리 모세 혈관을 원하는 설정으로 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 한 지점으로 가열하고 당깁니다. 집게를 사용하여 당겨낸 바늘 끝을 잘라냅니다. 막힘을 방지하기 위해, 블라스토셀 포부 바늘의 개구부는 미세 주입 바늘보다 커야한다.
마이크로인젝터에 연결된 바늘 홀더에 포부를 삽입하고 바늘 홀더를 미세 조작기에 부착합니다. MBS가 채워진 주입 트레이 또는 접시에 일찍 중간 가스트루라 단계 배아를 놓습니다. 동물 극 근처의 배아 표면 아래에 바늘을 삽입합니다.
해부 현미경을 통해 바늘과 배아를 관찰하는 동안 마이크로 인젝터의 채우기 버튼을 누릅니다. 몇 초 동안, 맑은 액체의 수준은 바늘에 상승하고 배아가 붕괴하고 오목하게됩니다. 주입 버튼을 한 번 이상 펄스하여 이물질이나 프로테아제가 들어 있는 바늘에 들어오는 흐린 백색 물질을 배출합니다.
면역 블롯에 분열 제품을 검출하려면, 항체에 따라 10 에서 20 배아 이상의 blastocele 액체를 흡인. 파이펫 핵없는 물의 마이크로 리터는 사출 트레이에 배치 된 파라핀 조각에. 물 방울에 바늘을 잠그고 주입 버튼을 눌러 blastocele 유체를 물에 방출합니다.
대안적으로, 파라필름에 직접 유체를 배출하고 평평해지는 것을 방지하기 위해, 더 낮은 압력하에서 유체를 추방하기 위해 주입 버튼을 펄스한다. 수확한 blastocele 액체를 얼음위에 멸균 미세원심분리기 튜브로 옮기고 핵이 없는 물을 추가하여 최종 부피를 30마이크로리터로 조정합니다. TGF-베타 전구체 단백질을 검출하기 위해, 블락토셀액고갈이 된 배아를 얼음에 있는 별도의 튜브로 이송한다.
초과 MBS를 제거하고 미리 냉각 된 배아 용액 버퍼200 마이크로 리터를 추가합니다. 배아를 완전히 균질화하기 위해 덩어리가 남아있을 때까지 파이펫을 10 ~ 20 번 위아래로 합니다. 10분 동안 냉장 된 미세 원심 분리기에서 균질화 된 배아를 원심 분리 한 다음 P200 파이펫을 사용하여 160 마이크로 리터를 제거하고 얼음에 새로운 튜브로 옮겨 튜브의 절반에 있는 흰색 노른자 단백질 및 기타 세포 이물질을 피하십시오.
마이크로원심 분리를 한 번 반복하고 투명한 상체의 128마이크로리터를 얼음의 새로운 튜브로 옮긴다. 이 시점에서, 제거된 배아 용액과 수집된 blastocele 액체는 원하는 만큼 영하 80도에서 보관될 수 있다. 제조업체의 지시에 따라 PNGase F와 트랜스 골기 네트워크를 통해 변형된 블라스코셀 액에 존재하는 칼 단백질을 탈충하한다.
sDS 젤에 더 응축 된 밴드로 마이그레이션 될 것 이다, 정확한 식별에 도움이 될 수 있는. 블라스토셀과 리세이트에서 프로도메인 단편 단량제 및 전개된 단백질을 평가하기 위해 4X 샘플 버퍼를 15마이크로리터 블래스토셀 유체및 15마이크로리터의 정제된 배아 용액으로 줄이는 5개의 마이크로리터를 추가하여 감소 조건 하에서 단백질을 분석합니다. 블래스토셀레내의 활근 형질 또는 이성구리액 리간드의 형성을 평가하기 위해, 비환량 조건하에서 단백질을 분석하여 4X 샘플 버퍼를 나머지 15 마이크로리터에 추가한 다음 5분 동안 가열하여 얼음위에 놓습니다.
이러한 프로토콜을 사용한 후, 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 면역블롯은 myc epitope 태그를 인식하는 항체로 조사되었다. 감소 조건하에서, Bmp4 또는 Bmp7만 을 표현하는 배아로부터 의약하에, Bmp4 단량체와 갈라진 Bmp7 단량에 대응하는 느린 마이그레이션 밴드에 대응하는 단일 밴드가 검출되었다. 두 밴드는 Bmp4와 Bmp7을 공동 발현하는 배아에서 검출되었다.
단백질이 비감소 조건 하에서 분리되었을 때, Bmp4와 Bmp7. Bmp7 및 Bmp7 이종구형성을 공동 발현하는 배아에서 Bmp4 호모디머의 미량과 함께 중간 이동성의 단일 성숙한 Bmp4 및 7 이성구가 성역이 검출되었다. 그러나, 이 경우, 초과 Bmp7 형성 호모디머와 배아는 Bmp4와 Bmp7을 공동 발현.
이러한 결과는 Bmp4와 7이 제노푸스 라예비스 배아에서 공동 발현될 때 우선적으로 이종성구를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 이 실험에서 순수한 블라토셀을 수집하는 것은 정확한 바늘 처리 경험이 필요한 가장 중요한 단계입니다. 그래서 그냥 시도하고 오류를 수정 유지.
이 절차는 BMP 이성애가 형성되는지 여부와 어떤 아미노산이 이것에 중요한지 테스트합니다. 다음 단계, 녹핀 마우스는 이러한 아미노산이 포유류 발달 중에 기능적으로 중요한지 여부를 묻기 위해 생성될 수 있다.
