Este protocolo se puede utilizar para estudiar el proceso por el cual una gama más amplia de proteínas precursoras segregadas, incluidos los miembros de la familia TGF-beta, se convierten en proteínas activas después de la escisión proteolítica. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona métodos muy rápidos y económicos para obtener un producto de escisión TGF-beta altamente concentrado in vivo en condiciones visualizadas. Para empezar, después de la inyección al día siguiente, retire la solución de Ficoll y cualquier embrión muerto o moribundo, luego enjuague los embriones una o dos veces con MBS y culture los embriones en MBS en el banco a temperatura ambiente o a 16 grados centígrados en la incubadora para ralentizar el desarrollo.
Calentar y tirar de los capilares de vidrio hasta un punto fino utilizando un arrancador de micropipetas con los ajustes deseados. Usando forrceps, recorte la punta de una aguja tirada. Para evitar la obstrucción, la abertura de la aguja de aspiración de blastocele debe ser más grande que la aguja de microinyección.
Inserte la aguja de aspiración en el soporte de la aguja conectado al microinyector y conecte el soporte de la aguja al micromanipulador. Coloque los embriones en etapa de gastrula temprana a media en una bandeja o plato de inyección lleno de MBS. Inserte la aguja debajo de la superficie del embrión cerca del polo animal.
Presione el botón de relleno en el microinyector mientras observa la aguja y el embrión a través de un microscopio de disección. Durante unos segundos, el nivel de líquido claro aumenta en la aguja y el embrión colapsa y se vuelve cóncavo. Pulse el botón de inyección una o más veces para expulsar cualquier materia blanca turbia que entre en la aguja que contenga escombros o proteasas.
Para detectar los productos de escisión en inmunoblots, aspire el líquido blastocele de 10 a 20 embriones o más dependiendo del anticuerpo. Pipetee un microlitro de agua sin núcleo sobre una pieza de parafina colocada en la bandeja de inyección. Sumerja la aguja en la gota de agua y presione el botón de inyección para disipar el líquido de blastocele en el agua.
Alternativamente, para expulsar el fluido directamente sobre la parapelícula y evitar que se aplane, presione el botón de inyección para expulsar el fluido a una presión más baja. Transfiera el líquido de blastocele cosechado a un tubo de microcentrífuga estéril sobre hielo y agregue agua sin núcleo para ajustar el volumen final a 30 microlitros. Para detectar las proteínas precursoras de TGF-beta, transfiera los embriones agotados del líquido blastocele a un tubo separado en el hielo.
Elimine el exceso de MBS y agregue 200 microlitros de tampón de lisado embrionario pre-enfriado. Para homogeneizar completamente los embriones, pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces hasta que no queden grumos. Centrifugar los embriones homogeneizados en una microcentrífuga refrigerada a 10,000 veces G durante 10 minutos, luego retirar 160 microlitros del sobrenadante usando una pipeta P200 y transferir a un nuevo tubo en hielo, teniendo cuidado de evitar las proteínas de la yema blanca y otros desechos celulares en la mitad inferior del tubo.
Repita la microcentrifugación una vez y transfiera 128 microlitros del sobrenadante transparente a un nuevo tubo sobre hielo. En este punto, los lisatos embrionarios eliminados y el líquido blastocele recolectado se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados durante el tiempo que se desee. Desglicosila las proteínas escindidas presentes en el líquido blastocele modificado a través de la red trans-Golgi con PNGasa F siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los productos desglicosilados migrarían como una banda más condensada en los geles SDS, lo que puede ayudar en la identificación precisa. Para evaluar los monómeros de fragmentos de prodominio y las proteínas desplegadas en el blastocele y el lisato, analice las proteínas en condiciones reductoras agregando cinco microlitros de tampón de muestra reductor 4X a 15 microlitros de líquido blastocele y 15 microlitros de lisado embrionario clarificado. Para evaluar la formación de ligandos homodiméricos o heterodmericos escindidos en el blastocele, analice las proteínas en condiciones no reductoras agregando cinco microlitros de tampón de muestra 4X no reductor a los 15 microlitros restantes de líquido blastocele, luego caliéntelo durante cinco minutos y colóquelo en hielo.
Después de usar este protocolo, las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y los inmunoblots fueron sondeadas con anticuerpos que reconocieron la etiqueta del epítopo myc. En las condiciones reductoras, en los lisados de embriones que expresan solo Bmp4 o Bmp7, se detectó una sola banda correspondiente a monómeros Bmp4 escindidos y una banda migratoria más lenta correspondiente a monómeros Bmp7 escindidos. Ambas bandas se detectaron en embriones co-expresando Bmp4 y Bmp7.
Cuando las proteínas se separaron en condiciones no reductoras, se detectó una sola banda madura de Bmp4 y 7 heterodímeros de movilidad intermedia junto con una traza de homodímero Bmp4 en los embriones que coextrofizan Bmp4 y Bmp7. También se observó la formación de heterodímeros Bmp4 y Bmp7 cuando los niveles de proteína Bmp7 eran altos. Sin embargo, en este caso, el exceso de Bmp7 formó homodímeros y embriones co-expresados Bmp4 y Bmp7.
Estos resultados demostraron que Bmp4 y 7 forman preferentemente heterodímeros cuando se co-expresan en embriones de Xenopus laevis. En este experimento, la recolección de blastocele puro es el paso más importante que requiere una experiencia precisa en el manejo de agujas. Así que sigue intentando y corrigiendo errores.
Este procedimiento prueba si se forman heterodímeros BMP y qué aminoácidos son importantes para esto. El siguiente paso, se puede generar un ratón knockin para preguntar si estos aminoácidos son funcionalmente importantes durante el desarrollo de los mamíferos.
