Bu protokol, TGF-beta aile üyeleri de dahil olmak üzere daha geniş bir ayrılmış öncül protein yelpazesinin proteolitik bölünmeyi takiben aktif proteinlere dönüştürüldüğü süreci incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün temel avantajı, görselleştirilmiş durumda yüksek konsantre TGF-beta dekolte ürününü in vivo elde etmek için çok hızlı ve ucuz yöntemler sağlamasıdır. Başlangıç olarak, ertesi gün enjeksiyondan sonra, Ficoll çözeltisini ve ölü veya ölmekte olan embriyoları çıkarın, ardından embriyoları MBS ile bir veya iki kez durulayın ve gelişimi yavaşlatmak için embriyoları oda sıcaklığında veya inkübatörde 16 santigrat derecede yedek kulübesinde MBS'de kültüre edin.
cam kılcal damarları istediğiniz ayarlara sahip bir mikropipette çekmeci kullanarak ısıtın ve ince bir noktaya çekin. Tokparlap kullanarak, çekilmiş bir iğnenin ucunu kırpın. Tıkanmasını önlemek için blastosel aspirasyon iğnesinin açılması mikroenjeksiyon iğnesinden daha büyük olmalıdır.
Aspirasyon iğnesini mikroenjektöre bağlı iğne tutucuya yerleştirin ve iğne tutucuyu mikromanipülatöre takın. Gastrula evre embriyolarını MBS dolu bir enjeksiyon tepsisine veya kabına erken ve orta yerlere yerleştirin. İğneyi embriyo yüzeyinin altına hayvan kutbuna yakın bir şekilde yerleştirin.
Bir diseksiyon mikroskobu ile iğneyi ve embriyoyu gözlemlerken mikroinjektördeki doldurma düğmesine basın. Birkaç saniye içinde, iğnede berrak sıvı seviyesi yükselir ve embriyo çöker ve içbükey hale gelir. Enkaz veya proteaz içeren iğneye giren bulutlu beyaz maddeyi çıkarmak için enjekte düğmesini bir veya daha fazla kez darbe.
İmmünoblotlardaki bölünme ürünlerini tespit etmek için, antikora bağlı olarak 10 ila 20 embriyo veya daha fazla blastosül sıvısını epire edin. Pipet enjeksiyon tepsisine yerleştirilen bir parafin parçasına bir mikroliter çekirdeksiz su. İğneyi su damlasına batırın ve blastosel sıvısını suya dağıtmak için enjekte düğmesine basın.
Alternatif olarak, sıvıyı doğrudan parafilme çıkarmak ve düzleştirmesini önlemek için, sıvıyı daha düşük basınç altında dışarı çıkarmak için enjekte düğmesini darbeleyin. Hasat edilen blastosen sıvısını buz üzerinde steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve son hacmi 30 mikrolitreye ayarlamak için çekirdeksiz su ekleyin. TGF-beta öncül proteinleri tespit etmek için, blastosel sıvısı tükenmiş embriyoları buz üzerinde ayrı bir tüpe aktarın.
Fazla MBS'yi çıkarın ve 200 mikrolitre önceden soğutulmuş embriyo lysate tamponu ekleyin. Embriyoları tamamen homojenize etmek için, küme kalmayana kadar 10 ila 20 kez pipet yukarı ve aşağı. Homojenize embriyoları 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de soğutulmuş bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin, ardından bir P200 pipet kullanarak süpernatantın 160 mikrolitresini çıkarın ve tüpün altındaki beyaz yumurta sarısı proteinlerinden ve diğer hücresel döküntülerden kaçınmaya dikkat ederek buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın.
Mikrosantrifüjasyonu bir kez tekrarlayın ve berrak süpernatantın 128 mikrolitresini buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Bu noktada temizlenmiş embriyo lysates ve toplanan blastosen sıvısı istanildiği sürece eksi 80 santigrat derecede depolanabilir. Üreticinin talimatlarını izleyerek PNGase F ile trans-Golgi ağı üzerinden modifiye edilmiş blastosel sıvısında bulunan yarıklı proteinleri deglycosylate edin.
Deglikosillenmiş ürünler, SDS jellerinde daha yoğun bir bant olarak göç eder ve bu da doğru tanımlamaya yardımcı olabilir. Blastosele ve lisattaki prodomain parça monomerlerini ve katlanmamış proteinleri değerlendirmek için, 4X numune tamponunun 15 mikrolitre blastosel sıvısına ve 15 mikrolitre netleştirilmiş embriyo lisatuna düşürülmesinin beş mikrolitresini ekleyerek proteinleri azaltıcı koşullar altında analiz edin. Blastosende bölünmüş homodimerik veya heterodimerik ligandların oluşumunu değerlendirmek için, kalan 15 mikrolitre blastosel sıvısına beş mikrolitre azaltmayan 4X numune tamponu ekleyerek proteinleri azaltıcı olmayan koşullar altında analiz edin, ardından beş dakika ısıtın ve buza yerleştirin.
Bu protokol kullanılarak proteinler SDS-PAGE ile ayrıldı ve immünoblotlar myc epitop etiketini tanıyan antikorlarla araştırıldı. Azaltıcı koşullar altında, sadece Bmp4 veya Bmp7'yi ifade eden embriyolardan elde edilen elyatlarda, bölünmüş Bmp4 monomerlerine karşılık gelen tek bir bant ve bölünmüş Bmp7 monomerlerine karşılık gelen daha yavaş bir göç bandı tespit edildi. Her iki bant da Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade eden embriyolarda tespit edildi.
Proteinler azaltıcı olmayan koşullarda ayrıldığında, Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade eden embriyolarda bmp4 homodimer iz miktarı ile birlikte tek bir olgun Bmp4 ve 7 heterodimer ara hareketlilik bandı tespit edildi. Bmp7 protein düzeyleri yüksek olduğunda Bmp4 ve Bmp7 heterodimer oluşumu da gözlendi. Bununla birlikte, bu durumda, fazla Bmp7 homodimerler oluşturdu ve embriyolar Bmp4 ve Bmp7'yi birlikte ifade etti.
Bu sonuçlar, Xenopus laevis embriyolarında birlikte ifade edildiğinde Bmp4 ve 7'nin tercihen heterodimer oluşturduğunu göstermiştir. Bu deneyde, saf blastosen toplamak, hassas iğne taşıma deneyimi gerektiren en önemli adımdır. Bu yüzden denemeye ve hataları düzeltmeye devam edin.
Bu prosedür BMP heterodimerlerinin oluşup oluşmadığını ve bunun için hangi amino asitlerin önemli olduğunu test eder. Bir sonraki adım, bu amino asitlerin memeli gelişimi sırasında işlevsel olarak önemli olup olmadığını sormak için knockin faresi üretilebilir.
