Este protocolo pode ser usado para estudar o processo pelo qual uma gama mais ampla de proteínas precursoras segregadas, incluindo membros da família TGF-beta, são convertidas em proteínas ativas após o decote protelítico. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece métodos muito rápidos e baratos para obter um produto de decote TGF-beta altamente concentrado in vivo sob condição visualizada. Para começar, após a injeção no dia seguinte, remova a solução Ficoll e quaisquer embriões mortos ou moribundos, depois enxágue os embriões uma ou duas vezes com MBS e cultue os embriões em MBS no banco à temperatura ambiente ou a 16 graus Celsius na incubadora para retardar o desenvolvimento.
Aqueça e puxe os capilares de vidro para um ponto fino usando um puxador de micropipette com as configurações desejadas. Usando fórceps, corte a ponta de uma agulha puxada. Para evitar entupimento, a abertura da agulha de aspiração blastocele deve ser maior do que a agulha de microinjeção.
Insira a agulha de aspiração no suporte da agulha conectada ao microinjetor e conecte o suporte da agulha ao micromanipulador. Coloque embriões de estágio gastrula precoces e médios em uma bandeja ou prato de injeção preenchidos com MBS. Insira a agulha abaixo da superfície do embrião perto do polo animal.
Pressione o botão de preenchimento no microinjetor enquanto observa a agulha e o embrião através de um microscópio de dissecação. Ao longo de alguns segundos, o nível de fluido claro sobe na agulha e o embrião entra em colapso e se torna côncavo. Pulso o botão de injeção uma ou mais vezes para ejetar qualquer matéria branca nublada que entre na agulha contendo detritos ou proteases.
Para detectar os produtos de decote em imunoblots, aspire o fluido blastocele de 10 a 20 embriões ou mais, dependendo do anticorpo. Pipeta um microliter de água sem núcleo em uma peça de parafina colocada na bandeja de injeção. Submergir a agulha na gota d'água e pressione o botão de injeção para dissipar o fluido blastocele na água.
Alternativamente, para ejetar o fluido diretamente no parafilme e evitar que ele se achate, pulso o botão de injeção para expulsar o fluido sob menor pressão. Transfira o fluido blastocele colhido para um tubo de microcentrifuuge estéril no gelo e adicione água sem núcleo para ajustar o volume final a 30 microliters. Para detectar proteínas precursoras TGF-beta, transfira os embriões esgotados do fluido blastocele para um tubo separado no gelo.
Remova o excesso de MBS e adicione 200 microliters de tampão de lise de embrião pré-refrigerado. Para homogeneizar totalmente os embriões, pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes até que não restem aglomerados. Centrifugar os embriões homogeneizados em uma microcentrifuuagem refrigerada a 10.000 vezes G por 10 minutos, depois remova 160 microliters do supernatante usando uma pipeta P200 e transfira para um novo tubo no gelo, tendo o cuidado de evitar as proteínas de gema branca e outros detritos celulares na metade inferior do tubo.
Repita a microcentrifugação uma vez e transfira 128 microlitres do supernatante claro para um novo tubo no gelo. Neste ponto, os lises de embrião limpos e o fluido blastocele coletado podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius pelo tempo desejado. Deglycosillate as proteínas cortadas presentes no fluido blastocele modificado através da rede trans-Golgi com PNGase F seguindo as instruções do fabricante.
Os produtos desglicosylated migrariam como uma banda mais condensada em géis SDS, o que pode ajudar na identificação precisa. Para avaliar os monômeros do fragmento de prodomínio e proteínas desdobradas na blastocele e na lise, analise as proteínas em condições de redução adicionando cinco microliters de redução de tampão amostral 4X a 15 microliters blastocele fluido e 15 microliters de embrião esclarecido. Para avaliar a formação de ligantes homodimericos ou heterodimericos cerrados na blastocele, analise as proteínas em condições não redutoras adicionando cinco microliters de tampão amostral 4X não redutor aos 15 microliters restantes do fluido blastocele, em seguida, aqueça-o por cinco minutos e coloque-o no gelo.
Após o uso deste protocolo, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE e os imunoblots foram sondados com anticorpos que reconheceram a tag de epítope mícica. Sob as condições de redução, nos lysates de embriões expressando apenas Bmp4 ou Bmp7, uma única banda correspondente aos monômeros Bmp4 cerrados e uma banda migratória mais lenta correspondente aos monômeros Bmp7 cerrados foram detectados. Ambas as bandas foram detectadas em embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7.
Quando as proteínas foram separadas em condições não redutoras, uma única faixa de mobilidade intermediária Bmp4 e 7 heterodôs madura foi detectada juntamente com uma quantidade de traço de homodimer Bmp4 nos embriões co-expressando Bmp4 e Bmp7. A formação de heterodimer Bmp4 e Bmp7 também foi observada quando os níveis de proteína Bmp7 eram altos. No entanto, neste caso, o excesso de Bmp7 formou homodimers e embriões co-expressos Bmp4 e Bmp7.
Esses resultados demonstraram que Bmp4 e 7 formam preferencialmente heterodimers quando co-expressos em embriões xenopus laevis. Neste experimento, coletar blastocele pura é o passo mais importante que requer uma experiência precisa de manuseio de agulhas. Então continue tentando e corrigindo erros.
Este procedimento testa se os heterodimers BMP formam e quais aminoácidos são importantes para isso. Próximo passo, o rato knockin pode ser gerado para perguntar se esses aminoácidos são funcionalmente importantes durante o desenvolvimento dos mamíferos.
