Dieses Protokoll kann verwendet werden, um den Prozess zu untersuchen, bei dem eine breitere Palette von getrennten Vorläuferproteinen, einschließlich Mitgliedern der TGF-beta-Familie, nach proteolytischer Spaltung in aktive Proteine umgewandelt wird. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es sehr schnelle und kostengünstige Methoden bietet, um hochkonzentriertes TGF-beta-Spaltprodukt in vivo unter sichtbaren Bedingungen zu erhalten. Entfernen Sie zunächst nach der Injektion am folgenden Tag Ficoll-Lösung und alle toten oder sterbenden Embryonen, spülen Sie die Embryonen dann ein- oder zweimal mit MBS aus und kultivieren Sie die Embryonen in MBS auf der Bank bei Raumtemperatur oder bei 16 Grad Celsius im Inkubator, um die Entwicklung zu verlangsamen.
Erhitzen und ziehen Sie die Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher mit den gewünschten Einstellungen auf einen feinen Punkt. Schneiden Sie mit einer Zette die Spitze einer gezogenen Nadel ab. Um ein Verstopfen zu vermeiden, sollte die Öffnung der Blastozele-Aspirationsnadel größer sein als die Mikroinjektionsnadel.
Führen Sie die Aspirationsnadel in den mit dem Mikroinjektor verbundenen Nadelhalter ein und befestigen Sie den Nadelhalter am Mikromanipulator. Legen Sie Embryonen im frühen bis mittleren Gastrula-Stadium in eine MBS-gefüllte Injektionsschale oder -schale. Führen Sie die Nadel unter die Embryooberfläche in der Nähe des Tierpols ein.
Drücken Sie den Füllknopf am Mikroinjektor, während Sie die Nadel und den Embryo durch ein Seziermikroskop beobachten. Über einige Sekunden steigt der Gehalt an klarer Flüssigkeit in der Nadel an und der Embryo kollabiert und wird konkav. Pulsieren Sie den Injektionsknopf ein oder mehrere Male, um trübe weiße Substanz, die in die Nadel eindringt, die Ablagerungen oder Proteasen enthält, auszustoßen.
Um die Spaltprodukte auf Immunoblots nachzuweisen, saugen Sie die Blastozele-Flüssigkeit von 10 bis 20 Embryonen oder mehr an, abhängig vom Antikörper. Pipetten Sie einen Mikroliter kernfreies Wasser auf ein Paraffinstück, das auf der Injektionsschale platziert ist. Tauchen Sie die Nadel in den Wassertropfen und drücken Sie den Injektionsknopf, um die Blastokele-Flüssigkeit in das Wasser zu zerstreuen.
Alternativ, um die Flüssigkeit direkt auf den Parafilm auszuwerfen und zu verhindern, dass sie abflacht, pulsieren Sie den Injektionsknopf, um die Flüssigkeit unter niedrigerem Druck auszustoßen. Die geerntete Blastozele-Flüssigkeit wird in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gegeben und kernfreies Wasser hinzugefügt, um das Endvolumen auf 30 Mikroliter einzustellen. Um TGF-beta-Vorläuferproteine nachzuweisen, übertragen Sie die erschöpften Embryonen der Blastokeleflüssigkeit in ein separates Röhrchen auf Eis.
Entfernen Sie überschüssiges MBS und fügen Sie 200 Mikroliter vorgekühlten Embryo-Lysatpuffer hinzu. Um die Embryonen vollständig zu homogenisieren, pipetten Sie 10 bis 20 Mal auf und ab, bis keine Klumpen mehr übrig bleiben. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Embryonen in einer gekühlten Mikrozentrifuge bei 10.000 mal G für 10 Minuten, entfernen Sie dann 160 Mikroliter des Überstands mit einer P200-Pipette und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen auf Eis, wobei Sie darauf achten, die weißen Eigelbproteine und andere Zelltrümmer in der unteren Hälfte des Röhrchens zu vermeiden.
Wiederholen Sie die Mikrozentrifugation einmal und übertragen Sie 128 Mikroliter des klaren Überstands in ein neues Rohr auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt können gereinigte Embryolysate und die gesammelte Blastozeleflüssigkeit bei minus 80 Grad Celsius so lange wie gewünscht gelagert werden. Deglycosylat der gespaltenen Proteine, die in Blastozeleflüssigkeit vorhanden sind, die durch das trans-Golgi-Netzwerk mit PNGase F modifiziert wurden, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
Die deglycosylierten Produkte würden als kondensierteres Band auf SDS-Gelen migrieren, was bei der genauen Identifizierung helfen kann. Um die Prodomänenfragmentmonomere und entfalteten Proteine in der Blastozele und im Lysat zu beurteilen, analysieren Sie die Proteine unter reduzierenden Bedingungen, indem Sie fünf Mikroliter 4X Probenpuffer auf 15 Mikroliter Blastozeleflüssigkeit und 15 Mikroliter geklärtes Embryolysat hinzufügen. Um die Bildung von gespaltenen homodimeren oder heterodimeren Liganden in der Blastozele zu beurteilen, analysieren Sie die Proteine unter nicht reduzierenden Bedingungen, indem Sie fünf Mikroliter nicht reduzierenden 4X-Probenpuffer zu den verbleibenden 15 Mikrolitern Blastozeleflüssigkeit hinzufügen, dann fünf Minuten lang erhitzen und auf Eis legen.
Nach Der Verwendung dieses Protokolls wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und die Immunoblots mit Antikörpern untersucht, die das myc-Epitop-Tag erkannten. Unter den reduzierenden Bedingungen wurden in den Lysaten von Embryonen, die nur Bmp4 oder Bmp7 exprimierten, ein einzelnes Band nachgewiesen, das gespaltenen Bmp4-Monomeren entspricht, und ein langsamer wanderndes Band, das gespaltenen Bmp7-Monomeren entspricht. Beide Bänder wurden in Embryonen nachgewiesen, die Bmp4 und Bmp7 co-exprimierten.
Wenn die Proteine unter nicht reduzierenden Bedingungen getrennt wurden, wurde ein einzelnes reifes Bmp4- und 7-Heterodimerband mittlerer Mobilität zusammen mit einer Spurenmenge an Bmp4-Homodimer in den Embryonen nachgewiesen, die Bmp4 und Bmp7 co-exprimierten. Bmp4- und Bmp7-Heterodimerbildung wurde auch beobachtet, wenn die Bmp7-Proteinspiegel hoch waren. In diesem Fall bildete jedoch das überschüssige Bmp7 Homodimere und Embryonen koexprimierten Bmp4 und Bmp7.
Diese Ergebnisse zeigten, dass Bmp4 und 7 bevorzugt Heterodimere bilden, wenn sie in Xenopus laevis Embryonen co-exprimiert werden. In diesem Experiment ist das Sammeln von reiner Blastocele der wichtigste Schritt, der eine präzise Nadelhandhabung erfordert. Also versuchen Sie es einfach weiter und beheben Sie Fehler.
Bei diesem Verfahren wird getestet, ob sich BMP-Heterodimere bilden und welche Aminosäuren dafür wichtig sind. Im nächsten Schritt kann die Knockin-Maus generiert werden, um zu fragen, ob diese Aminosäuren während der Entwicklung von Säugetieren funktionell wichtig sind.
