在本视频中，我们展示了如何使用七点评分系统来量化秀丽隐杆线虫中多巴胺能神经元树突形态的变化。目前，在量化蠕虫神经变性的分析方法方面存在很大差异。此外，一些现有的技能只关注细胞体，对某些类型和水平的损伤不敏感。
引入该评分系统的目的是提供在各级损伤下捕获神经变性的全面图像的能力，并提供一个通用系统来支持秀丽隐杆线虫多巴胺能神经变性研究的一致性。在这里，我们将演示如何在荧光下对神经元进行成像，为这些神经元的树突分配分数，并预览如何显示和解释结果。对于每个实验组，将20至30个蠕虫移液或选择到与成像显微镜兼容的成像平台上。
最常见的平台包括安装在带有盖玻片上的2%琼脂糖垫，以及含有100微升或小于100微升液体介质的孔体积的96孔板。让蠕虫完全瘫痪。这可能需要几分钟时间。
将准备好的成像平台加载到能够进行z轴捕获的成像显微镜中。首先在明场中定位蠕虫的头部区域，然后使用成像显微镜在单色GFP荧光下定位。此处以 400 倍放大倍率显示蠕虫。
滚动焦点以查找树突清晰的上限和下限。将这些值设置为 z 堆栈图像捕获的上限和下限。选择所需的音高。
这里我们使用一个千分尺。单击以捕获 GFP 荧光通道中的 z-stack 图像。对于每个z-stack，使用显微镜软件或外部图像分析软件打开图像文件。
将堆栈加载到软件中，并将堆栈压缩为单个拼合图像。手动或使用自动上链软件在治疗组之间和治疗组内对齐图像。一次处理一个神经元图像。
从四个 CEP 树突中选择一个来评估凸起、断裂和不规则性，包括弯曲、扭结和曲线。当鼻子位于图像顶部时，建议从左到右进行评分，以确保评分的可重复性。使用这些准则，为每个树突分配一个分数值。
对于没有可见损伤的树突，得分为0分;对于不规则但没有斑点或破损的树突，得分为1;对于少于5个凸点的树突，得分为2;对于5到10个凸点的树突，得分为3;对于超过10个凸点和/或破损，去除高达25%的树突，得分为4分， 去除 25% 至 75% 的树突的破损得分为 5 分，如果树突超过 75%，则得分为 6 分。如果在单个树突中满足多个标准，请考虑与最高分数对应的标准。在与此视频相关的文章图1中找到的这些代表性评分图像可用作参考。
为了演示评分，我们将演练如何为几个示例神经元图像分配分数。从顶部最树突开始，没有可见的斑点，断裂或不规则。分配零分。
第二个树突有大约14个凸起，没有可见的断裂。打四分。由于与第二枝晶重叠，无法完整地看到第三枝晶，无法评分。
最底部的枝晶有大约11个凸起和一些断裂。打五分。在此图像中，只有三个树突是可评分的，因为在 z 堆栈捕获中未完全捕获一个树突。
三个可见的树突上没有气泡。因此，这将从上到下得分为零，零，并且由于这里的扭结，一个1。最后，在这张图中，所有四个树突都损失了75%以上。
这里的所有树突都获得六分。记录所有分数。此时分数可能是非盲的。
此处使用的分数模板可在补充文件中找到。将神经变性评分计数除以治疗组中评分的树突总数。以每个神经变性评分时治疗组内树突的比例提供数据。
我们的评分系统用于评估鱼藤酮暴露后L4幼虫期BY200秀丽隐杆线虫的神经变性。此处显示的数据与每个实验组的每个得分值处的树突总数的比例一样。我们认为每个树突得分为n 1。
在该图中，可以理解对鱼藤酮暴露的剂量依赖性神经变性反应，并且清楚地显示了评分分布的特定细分。根据独立性的卡方检验，这些实验组在统计学上是不同的，并辅以用于多重比较的Bonferroni校正。在本视频中，我们展示了如何使用我们实验室开发的七点量表来量化秀丽隐杆线虫中多巴胺能神经元形态改变和变性的水平。
使用评分方法可促进分析的一致性，并允许比较蠕虫中的神经变性研究。我们的评分系统可用于分析来自秀丽隐杆线虫实验的数据，这些实验使用细胞特异性荧光报告基因，例如dat-1多巴胺转运蛋白基因，允许多巴胺能神经元的可视化。现在，请在本文的补充材料中找到一组带有评论的练习图像，这些图像可用于训练，校准和评估新手使用此方法的研究人员的评分一致性。
