In diesem Video zeigen wir, wie man ein Sieben-Punkte-Scoring-System verwendet, um Veränderungen der dopaminergen Neuronen-Dendritenmorphologie in C. elegans zu quantifizieren. Derzeit gibt es große Unterschiede in den analytischen Methoden zur Quantifizierung der Neurodegeneration bei Würmern. Darüber hinaus konzentrieren sich einige vorhandene Fähigkeiten nur auf Zellkörper und sind nicht empfindlich gegenüber bestimmten Arten und Ebenen von Schäden.
Der Zweck der Einführung dieses Scoring-Systems besteht darin, ein umfassendes Bild der Neurodegeneration auf allen Schadensebenen zu erfassen und ein universelles System zur Unterstützung der Konsistenz in der dopaminergen Neurodegenerationsforschung von C.elegans bereitzustellen. Hier werden wir demonstrieren, wie man Neuronen unter Fluoreszenz abbildet, den Dendriten dieser Neuronen Scores zuweist und eine Vorschau anzeigt, wie die Ergebnisse angezeigt und interpretiert werden können. Pipettieren oder wählen Sie für jede experimentelle Gruppe 20 bis 30 Würmer auf eine Bildgebungsplattform, die mit dem Bildgebungsmikroskop kompatibel ist.
Zu den gebräuchlichsten Plattformen gehören 2% Agarose-Pads, die auf Glasobjektträgern mit einem Abdeckschlupf montiert sind, und 96-Well-Platten mit Wellvolumina bei oder weniger als 100 Mikroliter flüssigem Medium. Lassen Sie Würmer vollständig lähmen. Dies kann einige Minuten dauern.
Laden Sie die vorbereitete Bildgebungsplattform in ein Bildgebungsmikroskop, das Z-Stack-Aufnahmen machen kann. Lokalisieren Sie die Kopfregion des Wurms zuerst im Hellenfeld und dann unter einer einfarbigen GFP-Fluoreszenz mit dem abbildenden Mikroskop. Der Wurm ist hier in einer 400-fachen Vergrößerung dargestellt.
Scrollen Sie durch den Fokus, um obere und untere Grenzen zu finden, an denen die Dendriten klar sind. Legen Sie diese als obere und untere Grenzen für die Z-Stack-Bilderfassung fest. Wählen Sie die gewünschte Tonhöhe aus.
Hier verwenden wir ein Mikrometer. Klicken Sie hier, um Z-Stack-Bilder im GFP-Fluoreszenzkanal aufzunehmen. Öffnen Sie für jeden Z-Stack die Bilddatei entweder mit der Mikroskopsoftware oder einer externen Bildanalysesoftware.
Laden Sie den Stack in die Software und komprimieren Sie den Stack in ein einzelnes reduziertes Bild. Richten Sie Bilder zwischen und innerhalb von Behandlungsgruppen manuell oder mithilfe der automatischen Aufzugssoftware aus. Arbeiten Sie mit jeweils einem Neuronenbild.
Wählen Sie einen der vier CEP-Dendriten, um Blebs, Brüche und Unregelmäßigkeiten, einschließlich Biegungen, Knicke und Kurven, zu beurteilen. Es wird empfohlen, von links nach rechts zu punkten, wenn sich die Nase oben im Bild befindet, um die Wiederholbarkeit der Bewertung zu gewährleisten. Weisen Sie anhand dieser Richtlinien jedem Dendriten einen Bewertungswert zu.
Weisen Sie eine Punktzahl von Null für Dendriten ohne sichtbare Schäden, eine Punktzahl von eins für Dendriten mit Unregelmäßigkeiten, aber ohne Blobbing oder Bruch, eine Punktzahl von zwei für Dendriten mit weniger als fünf Blebs, eine Punktzahl von drei für zwischen fünf und 10 Blebs, eine Punktzahl von vier für über 10 Blebs und/oder Bruch, die bis zu 25% des Dendriten entfernen, zu. eine Punktzahl von fünf für den Bruch, der 25 bis 75% des Dendriten entfernt, und eine Punktzahl von sechs, wenn mehr als 75% des Dendriten fehlen. Wenn innerhalb eines einzelnen Dendriten mehrere Kriterien erfüllt sind, berücksichtigen Sie die Kriterien, die der höchsten Punktzahl entsprechen. Diese repräsentativen Bewertungsbilder in Abbildung 1 des mit diesem Video verknüpften Artikels können als Referenz verwendet werden.
Um das Scoring zu demonstrieren, werden wir durch die Zuweisung von Scores zu einigen Beispiel-Neuronenbildern gehen. Beginnen Sie mit dem obersten Dendriten, es gibt keine sichtbaren Blebs, Brüche oder Unregelmäßigkeiten. Weisen Sie eine Punktzahl von Null zu.
Der zweite Dendrit hat etwa 14 Blebs und keine sichtbaren Brüche. Weisen Sie eine Punktzahl von vier zu. Der dritte Dendrit kann aufgrund der Überschneidung mit Dendrit zwei nicht in seiner Gesamtheit gesehen werden und kann nicht bewertet werden.
Der unterste Dendrit hat etwa 11 Blebs und ein paar Brüche. Weisen Sie eine Punktzahl von fünf zu. In diesem Bild sind nur drei Dendriten scorable, da ein Dendrit bei der Z-Stack-Erfassung nicht vollständig erfasst wurde.
Es gibt kein Blebbing auf den drei sichtbaren Dendriten. Dies würde also von oben nach unten als Eine Null, eine Null und aufgrund des Knicks hier eine Eins bewertet werden. Schließlich sind in diesem Bild alle vier Dendriten zu mehr als 75% verloren.
Alle Dendriten erhalten hier eine Punktzahl von sechs. Zeichnen Sie alle Ergebnisse auf. Partituren können zu diesem Zeitpunkt nicht verblindet sein.
Die hier verwendete Score-Vorlage finden Sie in den Ergänzenden Dateien. Teilen Sie den Neurodegeneration-Score durch die Gesamtzahl der dendriten, die in der Behandlungsgruppe bewertet wurden. Präsentieren Sie die Daten als Anteil der Dendriten innerhalb der Behandlungsgruppe bei jedem Neurodegeneration-Score.
Unser Scoring-System wurde verwendet, um die Neurodegeneration im L4-Larvenstadium BY200 C.elegans nach Rotenonexposition zu beurteilen. Die Daten werden hier wie bei den Anteilen der Gesamtzahl der Dendriten bei jedem Scorewert für jede Versuchsgruppe dargestellt. Wir betrachten jeden Dendriten, der mit n 1 bewertet wird.
In dieser Abbildung kann eine dosisabhängige Neurodegenerationsreaktion auf die Rotenone-Exposition abgeschätzt werden, und die spezifische Aufschlüsselung der Score-Verteilung wird deutlich dargestellt. Diese experimentellen Gruppen unterschieden sich statistisch nach einem Chi-Quadrat-Test für die Unabhängigkeit, ergänzt durch eine Bonferroni-Korrektur für mehrfache Vergleiche. In diesem Video haben wir gezeigt, wie wir die in unserem Labor entwickelte Sieben-Punkte-Skala verwenden können, um den Grad der dopaminergen neurogenen morphologischen Veränderung und Degeneration in C. elegans zu quantifizieren.
Die Verwendung der Scoring-Methode fördert die Konsistenz in der Analyse und ermöglicht den Vergleich zwischen Neurodegenerationsforschungsstudien bei Würmern. Unser Scoring-System kann verwendet werden, um Daten aus C.elegans-Experimenten zu analysieren, die zellspezifische fluoreszierende Reporter verwenden, wie z.B. das Dat-1-Dopamintransporter-Gen, das die Visualisierung dopaminerger Neuronen ermöglicht. Bitte finden Sie nun einen Übungssatz von Bildern mit Kommentaren, die verwendet werden können, um die Scoring-Konsistenz von Forschern, die mit dieser Methode neu sind, zu trainieren, zu kalibrieren und zu bewerten.
