Bu videoda, C.elegans'ta dopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Şu anda solucanlarda nörodejenerasyonun ölçülmesinde analitik yöntemlerde büyük bir değişiklik var. Ayrıca, bazı mevcut beceriler yalnızca hücre gövdelerine odaklanır ve belirli hasar türlerine ve seviyelerine duyarlı değildir.
Bu puanlama sisteminin tanıtılmasının amacı, her hasar seviyesinde nörodejenerasyonun kapsamlı bir resmini yakalama ve C.elegans dopaminerjik nörodejenerasyon araştırmalarında tutarlılığı destekleyecek evrensel bir sistem sağlamaktır. Burada, nöronların floresan altında nasıl görüntüleneceğini, bu nöronun dendritlerine puanların nasıl atanacağını ve sonuçların nasıl görüntüleneceğini ve yorumlanacağını önizleyeceğiz. Her deney grubu için pipet veya görüntüleme mikroskobu ile uyumlu bir görüntüleme platformuna 20 ila 30 solucan seçin.
En yaygın platformlar arasında kapak kayması olan cam slaytlara monte edilmiş%2 agarose pedleri ve 100 mikrolitreden daha az sıvı ortamda kuyu hacimleri içeren 96 kuyu plakaları bulunur. Solucanların tamamen felç etmesine izin verin. Bu birkaç dakika sürebilir.
Hazırlanan görüntüleme platformunu z-stack yakalama yapabilen bir görüntüleme mikroskobuna yükleyin. Görüntüleme mikroskobu kullanarak solucanın kafa bölgesini önce parlak alanda, ardından tek renkli GFP floresan altında bulun. Solucan burada 400x büyütme ile gösterilir.
Dendritlerin açık olduğu üst ve alt sınırları bulmak için odak boyunca ilerleyin. Z yığını görüntü yakalama için bunları üst ve alt sınırlar olarak ayarlayın. İstediğiniz perdeyi seçin.
Burada bir mikrometre kullanıyoruz. GFP floresan kanalında z yığını görüntülerini yakalamak için tıklatın. Her z yığını için, mikroskop yazılımını veya harici bir görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü dosyasını açın.
Yığını yazılıma yükleyin ve yığını tek bir düzleştirilmiş görüntüye sıkıştırın. Görüntüleri tedavi grupları arasında ve içinde manuel olarak veya otomatik sargı yazılımı kullanarak hizalayın. Aynı anda bir nöron görüntüsüyle çalışın.
Bükülmeler, bükülmeler ve eğriler de dahil olmak üzere bip, mola ve düzensizlikleri değerlendirmek için dört CEP dendritinden birini seçin. Burun görüntünün üst kısmındayken soldan sağa puanlama, puanlamada tekrarlanabilirliği sağlamak için önerilir. Bu yönergeleri kullanarak, her dendrite bir puan değeri atayın.
Görünür hasarı olmayan dendritler için sıfır puan, düzensizlikleri olan ancak kabarcık veya kırılma olmayan dendritler için bir puan, beşten az blebs olan dendritler için iki puan, beş ila 10 bleb arasında üç puan, 10'dan fazla bleb için dört puan ve/ veya dendritin% 25'ine kadar kaldırma, dendritin% 25 ila 75'ini kaldıran kırılma için beş puan ve dendritin% 75'inden fazlası yoksa altı puan. Tek bir dendrit içinde birden çok ölçüt karşılanırsa, en yüksek puana karşılık gelen ölçütleri göz önünde bulundurun. Bu video ile ilişkili makalenin Şekil 1'inde bulunan bu temsili puanlama görüntüleri referans olarak kullanılabilir.
Puanlamayı göstermek için, birkaç örnek nöron görüntüsüne puan atama konusunda yürüyeceğiz. En üstteki dendritle başlayın, görünür bir bıkkınlık, kırılma veya düzensizlik yoktur. Sıfır puan atayın.
İkinci dendritte yaklaşık 14 bip vardır ve görünür kırılma yoktur. Dört puan atayın. Üçüncü dendrit, dendrit iki ile çakışma nedeniyle bütünüyle görülemez ve puanlanamaz.
En alttaki dendrit yaklaşık 11 blebs ve birkaç molaya sahiptir. Beş puan atayın. Bu görüntüde, bir dendrit z yığını yakalamada tam olarak yakalanmadığı için yalnızca üç dendrit küçümsenebilir.
Görünür üç dendritte leke yok. Yani bu yukarıdan aşağıya sıfır, sıfır ve buradaki bükülmeden dolayı bir puanlanacaktı. Son olarak, bu görüntüde, dört dendritin tümü% 75'ten fazla kayıptır.
Buradaki tüm dendritler altı puan alır. Tüm puanları kaydedin. Puanlar şu anda unblinded olabilir.
Burada kullanılan puan şablonu Ek Dosyalar'da bulunabilir. Nörodejenerasyon skorlarını tedavi grubunda alınan toplam dendrit sayısına bölün. Verileri her nörodejenerasyon skorunda tedavi grubundaki dendritlerin oranı olarak sunun.
Puanlama sistemimiz, rotenon maruziyeti sonrası L4 larva evresi BY200 C.elegans'ta nörodejenerasyonu değerlendirmek için kullanıldı. Veriler burada, her deneysel grup için her puan değerindeki toplam dendrit sayısının oranlarıyla birlikte görüntülenir. Her dendritin n 1 olarak puanlanmış olduğunu düşünüyoruz.
Bu şekilde, rotenon maruziyetine karşı doza bağımlı bir nörodejenerasyon yanıtı takdir edilebilir ve puan dağılımının spesifik kırılımı net bir şekilde görüntülenir. Bu deneysel gruplar, birden fazla karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi ile desteklenmiş bir bağımsızlık için Kikare testine göre istatistiksel olarak farklıydı. Bu videoda, C.elegans'ta dopaminerjik nöron morfolojik değişim ve dejenerasyon seviyelerini ölçmek için laboratuvarımızda geliştirilen yedi nokta ölçeğinin nasıl kullanılacağını gösterdik.
Puanlama yönteminin kullanılması analizde tutarlılığı teşvik eder ve solucanlarda nörodejenerasyon araştırma çalışmaları arasında karşılaştırmaya izin verir. Puanlama sistemimiz, dopaminerjik nöronların görselleştirilmesine izin veren dat-1 dopamin taşıyıcı geni gibi hücreye özgü floresan muhabirleri kullanan C.elegans deneylerinden elde edilen verileri analiz etmek için kullanılabilir. Şimdi, lütfen bu makalenin ek materyalinde bu yönteme yeni giren araştırmacıların puanlama tutarlılığını eğitmek, kalibre etmek ve değerlendirmek için kullanılabilecek yorum içeren bir uygulama seti bulun.
