En este video, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C.elegans. Actualmente hay una gran variación en los métodos analíticos para cuantificar la neurodegeneración en gusanos. Además, algunas habilidades existentes se centran solo en los cuerpos celulares y no son sensibles a ciertos tipos y niveles de daño.
El propósito de introducir este sistema de puntuación es proporcionar la capacidad de capturar una imagen completa de la neurodegeneración en todos los niveles de daño, y proporcionar un sistema universal para apoyar la consistencia en toda la investigación de neurodegeneración dopaminérgica de C.elegans. Aquí, demostraremos cómo obtener imágenes de neuronas bajo fluorescencia, asignar puntuaciones a las dendritas de esas neuronas y obtener una vista previa de cómo mostrar e interpretar los resultados. Para cada grupo experimental, pipetee o elija de 20 a 30 gusanos en una plataforma de imágenes compatible con el microscopio de imágenes.
Las plataformas más comunes incluyen almohadillas de agarosa al 2% montadas en portaobjetos de vidrio con un resbalón de cubierta y placas de 96 pozos que contienen volúmenes de pozos iguales o inferiores a 100 microlitros de medio líquido. Permita que los gusanos se paralicen por completo. Esto puede tardar varios minutos.
Cargue la plataforma de imágenes preparada en un microscopio de imágenes capaz de capturar z-stack. Localice la región de la cabeza del gusano primero en un campo brillante, luego bajo una fluorescencia GFP de un solo color utilizando el microscopio de imágenes. El gusano se muestra aquí en un aumento de 400x.
Desplácese por el foco para encontrar límites superiores e inferiores donde las dendritas estén claras. Establezca estos como límites superior e inferior para la captura de imágenes z-stack. Seleccione el tono deseado.
Aquí usamos un micrómetro. Haga clic para capturar imágenes de la pila z en el canal de fluorescencia GFP. Para cada pila z, abra el archivo de imagen utilizando el software de microscopio o un software de análisis de imágenes externo.
Cargue la pila en el software y comprima la pila en una sola imagen aplanada. Alinee las imágenes entre y dentro de los grupos de tratamiento manualmente o utilizando un software de bobinado automático. Trabaje con una imagen de neurona a la vez.
Elija una de las cuatro dendritas CEP para evaluar las ampollas, roturas e irregularidades, incluidas las curvas, torceduras y curvas. Se recomienda puntuar de izquierda a derecha cuando la nariz está en la parte superior de la imagen para garantizar la repetibilidad en la puntuación. Con estas directrices, asigne un valor de puntuación a cada dendrita.
Asigne una puntuación de cero para las dendritas sin daño visible, una puntuación de uno para las dendritas con irregularidades pero sin manchas o roturas, una puntuación de dos para las dendritas con menos de cinco ampollas, una puntuación de tres para entre cinco y 10 ampollas, una puntuación de cuatro para más de 10 ampollas y / o roturas que eliminen hasta el 25% de la dendrita, una puntuación de cinco por rotura eliminando del 25 al 75% de la dendrita, y una puntuación de seis si más del 75% de la dendrita está ausente. Si se cumplen varios criterios dentro de una sola dendrita, considere los criterios correspondientes a la puntuación más alta. Estas imágenes de puntuación representativas que se encuentran en la Figura 1 del artículo asociado con este video pueden usarse como referencia.
Para demostrar la puntuación, repasaremos la asignación de puntuaciones a algunas imágenes de neuronas de ejemplo. Comience con la parte superior más dendrita, no hay manchas visibles, roturas o irregularidades. Asigne una puntuación de cero.
La segunda dendrita tiene alrededor de 14 ampollas y no hay roturas visibles. Asigne una puntuación de cuatro. La tercera dendrita no se puede ver en su totalidad debido a la superposición con la dendrita dos y no se puede puntuar.
La dendrita inferior más tiene alrededor de 11 ampollas y algunos descansos. Asigne una puntuación de cinco. En esta imagen, solo tres dendritas son puntuables, ya que una dendrita no se capturó completamente en la captura de la pila z.
No hay sangrado en las tres dendritas visibles. Así que esto se anotaría de arriba a abajo como un cero, un cero, y debido a la torcedura aquí, un uno. Finalmente, en esta imagen, las cuatro dendritas están más del 75% perdidas.
Todas las dendritas aquí reciben una puntuación de seis. Registra todas las puntuaciones. Las puntuaciones pueden no estar cegadas en este momento.
La plantilla de puntuación utilizada aquí se puede encontrar en los Archivos suplementarios. Divida los recuentos de la puntuación de neurodegeneración por el número total de dendritas puntuadas en el grupo de tratamiento. Presentar los datos como proporción de dendritas dentro del grupo de tratamiento en cada puntuación de neurodegeneración.
Nuestro sistema de puntuación se utilizó para evaluar la neurodegeneración en el estadio larval L4 BY200 C.elegans después de la exposición a rotenona. Los datos se muestran aquí como con las proporciones del número total de dendritas en cada valor de puntuación para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrita puntuada como n 1.
En esta figura, se puede apreciar una respuesta de neurodegeneración dependiente de la dosis a la exposición a la rotenona, y se muestra claramente el desglose específico de la distribución de la puntuación. Estos grupos experimentales fueron estadísticamente diferentes según una prueba de Independencia de Chi cuadrado complementada por una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. En este vídeo, hemos demostrado cómo utilizar la escala de siete puntos desarrollada en nuestro laboratorio para cuantificar los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en C.elegans.
El uso del método de puntuación promueve la consistencia en el análisis y permite la comparación entre los estudios de investigación de neurodegeneración en gusanos. Nuestro sistema de puntuación se puede utilizar para analizar datos derivados de experimentos de C.elegans que utilizan reporteros fluorescentes específicos de la célula, como el gen transportador de dopamina dat-1 que permite la visualización de neuronas dopaminérgicas. Ahora, encuentre un conjunto de imágenes de práctica con comentarios que se puedan usar para entrenar, calibrar y evaluar la consistencia de puntuación de los investigadores nuevos en este método en el material complementario de este artículo.
