في هذا الفيديو، نعرض كيفية استخدام نظام تسجيل النقاط السبع لتحديد التغييرات في مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين في C.elegans. هناك حاليا تباين كبير في الأساليب التحليلية لتحديد التنكس العصبي في الديدان. بالإضافة إلى ذلك، تركز بعض المهارات الموجودة فقط على أجسام الخلايا ولا تتأثر بأنواع ومستويات معينة من الضرر.
الغرض من إدخال هذا النظام التهديف هو توفير القدرة على التقاط صورة شاملة للتجدد العصبي على جميع مستويات الضرر، وتوفير نظام عالمي لدعم الاتساق عبر أبحاث التنكس العصبي الدوبامين C.elegans. هنا، سوف نعرض كيفية تصوير الخلايا العصبية تحت الفلورسينس، وتعيين عشرات إلى التشعبات تلك الخلايا العصبية، ومعاينة كيفية عرض وتفسير النتائج. لكل مجموعة تجريبية، ماصة أو اختيار 20 إلى 30 الديدان إلى منصة التصوير متوافقة مع المجهر التصوير.
وتشمل المنصات الأكثر شيوعا 2٪ منصات الآغاروز المثبتة على الشرائح الزجاجية مع زلة غطاء، ولوحات 96 بئر تحتوي على كميات الآبار في أو أقل من 100 ميكرولتر من المتوسط السائل. السماح للديدان بالشلل تماما. قد يستغرق ذلك عدة دقائق.
قم بتحميل منصة التصوير المعدة في مجهر تصوير قادر على التقاط z-stack. حدد موقع منطقة رأس الدودة أولا في حقل ساطع ، ثم تحت مضان GFP لون واحد باستخدام مجهر التصوير. تظهر الدودة هنا في تكبير 400x.
التمرير من خلال التركيز للعثور على الحدود العليا والسفلى حيث التشعبات واضحة. تعيين هذه الحدود العليا والسفلى لالتقاط الصور z-المكدس. حدد الملعب المطلوب.
هنا نستخدم ميكرومتر واحد. انقر لالتقاط صور z-stack في قناة الإضاءة الفلورية GFP. لكل z-stack، افتح ملف الصورة باستخدام برنامج المجهر أو برنامج خارجي لتحليل الصور.
قم بتحميل المكدس في البرنامج وضغط المكدس في صورة واحدة مسطحة. قم بمحاذاة الصور بين مجموعات المعالجة وداخلها يدويا أو باستخدام برنامج اللف التلقائي. العمل مع صورة واحدة الخلايا العصبية في وقت واحد.
اختر واحدة من التشعبات CEP الأربعة لتقييم لblebs، فواصل، والمخالفات، بما في ذلك الانحناءات، مكامن الخلل، والمنحنيات. يوصى بتسجيل النقاط من اليسار إلى اليمين عندما يكون الأنف في أعلى الصورة لضمان التكرار في التسجيل. باستخدام هذه الإرشادات، قم بتعيين قيمة نقاط واحدة لكل ديندريت.
تعيين درجة الصفر لdendrites مع عدم وجود ضرر مرئي، ودرجة واحدة لdendrites مع مخالفات ولكن لا blobbing أو الكسر، ودرجة من اثنين لdendrites مع أقل من خمسة blebs، ودرجة من ثلاثة لبين خمسة و 10 blebs، ودرجة أربعة لأكثر من 10 blebs و / أو كسر إزالة ما يصل إلى 25٪ من dendrite، درجة من خمسة لكسر إزالة 25 إلى 75٪ من التشعب، ودرجة ستة إذا كان أكثر من 75٪ من التندريت غائبة. إذا تم استيفاء معايير متعددة داخل dendrite واحد، والنظر في المعايير المقابلة لأعلى درجة. يمكن استخدام صور تسجيل النقاط التمثيلية هذه الموجودة في الشكل 1 من المقالة المرتبطة بهذا الفيديو كمرجع.
لإثبات التهديف، وسوف نسير من خلال تعيين عشرات لعدد قليل من الصور الخلايا العصبية مثال. تبدأ مع أعلى معظم dendrite، لا توجد blebs مرئية، فواصل، أو مخالفات. تعيين درجة الصفر.
التشعب الثاني لديه حوالي 14 blebs وليس فواصل مرئية. تعيين درجة من أربعة. لا يمكن رؤية التشعب الثالث في مجمله بسبب التداخل مع dendrite اثنين ولا يمكن تسجيله.
أسفل معظم dendrite لديه حوالي 11 blebs وعدد قليل من فواصل. تعيين درجة من خمسة. في هذه الصورة، ثلاثة دندريت فقط قابلة للcorable، منذ لم يتم التقاط dendrite واحد تماما في التقاط z-كومة.
لا يوجد أي blebbing على التشعبات الثلاثة المرئية. اذا هذا سيسجل من الأعلى الى الأسفل كصفر، صفر، وبسبب الخلل هنا، واحد. وأخيرا ، في هذه الصورة ، وجميع dendrites الأربعة هي أكثر من 75 ٪ فقدت.
كل التشعبات هنا تحصل على درجة ستة سجل جميع الدرجات. قد تكون النتائج غير عمياء في هذا الوقت.
يمكن العثور على قالب النقاط المستخدم هنا في الملفات التكميلية. تقسيم الأرقام نقاط التنكس العصبي من قبل العدد الإجمالي للتشعبات المسجلة في مجموعة العلاج. تقديم البيانات كنسبة من التشعبات داخل مجموعة العلاج في كل درجة من درجات التنكس العصبي.
تم استخدام نظام التسجيل لدينا لتقييم التنكس العصبي في مرحلة L4 يرقة BY200 C.elegans بعد التعرض للروتينون. يتم عرض البيانات هنا كما هو الحال مع نسب العدد الإجمالي للdendrites في كل قيمة درجة لكل مجموعة تجريبية. ونحن نعتبر كل dendrite سجل ن 1.
في هذا الرقم ، يمكن تقدير استجابة التنكس العصبي المعتمدة على الجرعة للتعرض للروتينون ، ويتم عرض التوزيع المحدد لتوزيع النقاط بوضوح. وكانت هذه المجموعات التجريبية مختلفة إحصائيا وفقا لاختبار تشي تربيع للاستقلال تكملها تصحيح Bonferroni لمقارنات متعددة. في هذا الفيديو، أظهرنا كيفية استخدام مقياس النقاط السبع الذي تم تطويره في مختبرنا لتحديد مستويات التغيير المورفولوجي للخلايا العصبية الدوبامينية والانحطاط في C.elegans.
استخدام طريقة التهديف يعزز الاتساق في التحليل ويسمح للمقارنة بين دراسات أبحاث التنكس العصبي في الديدان. يمكن استخدام نظام التسجيل لدينا لتحليل البيانات المستمدة من تجارب C.elegans التي تستخدم المراسلين الفلوريين الخاصين بالخلايا ، مثل جين ناقل الدوبامين dat-1 الذي يسمح بتصور الخلايا العصبية الدوبامين. الآن ، يرجى العثور على مجموعة من الصور الممارسة مع التعليق التي يمكن استخدامها لتدريب ومعايرة وتقييم اتساق التهديف من الباحثين جديدة لهذه الطريقة في المواد التكميلية لهذه المادة.
