Neste vídeo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C.elegans. Há atualmente uma grande variação nos métodos analíticos de quantificação da neurodegeneração em vermes. Além disso, algumas habilidades existentes se concentram apenas em corpos celulares e não são sensíveis a certos tipos e níveis de dano.
O objetivo de introduzir este sistema de pontuação é fornecer a capacidade de capturar uma imagem abrangente da neurodegeneração em todos os níveis de dano, e fornecer um sistema universal para apoiar a consistência em toda a pesquisa de neurodegeneração dopaminérgica de C.elegans. Aqui, vamos demonstrar como visualizar neurônios sob fluorescência, atribuir pontuações aos dendritos desses neurônios e visualizar como exibir e interpretar os resultados. Para cada grupo experimental, pipeta ou escolha de 20 a 30 worms para uma plataforma de imagem compatível com o microscópio de imagem.
As plataformas mais comuns incluem almofadas de 2% de agarose montadas em lâminas de vidro com um deslizamento de cobertura, e placas de 96 poços contendo volumes de poços em ou menos de 100 microliters de meio líquido. Permita que os vermes paralisem completamente. Isso pode levar vários minutos.
Carregue a plataforma de imagem preparada em um microscópio de imagem capaz de capturas de pilha de z. Localize a região da cabeça do worm primeiro em campo brilhante, depois sob uma fluorescência GFP de cor única usando o microscópio de imagem. O verme é mostrado aqui em uma ampliação de 400x.
Role o foco para encontrar limites superiores e inferiores onde os dendritos estão claros. Defina-os como limites superiores e inferiores para captura de imagem em pilha de z. Selecione o tom desejado.
Aqui usamos um micrômetro. Clique para capturar imagens de pilha de z no canal de fluorescência GFP. Para cada pilha z, abra o arquivo de imagem usando o software de microscópio ou um software de análise de imagem externa.
Carregue a pilha no software e comprima a pilha em uma única imagem achatada. Alinhe imagens entre e dentro de grupos de tratamento manualmente ou usando software de enrolamento automático. Trabalhe com uma imagem de neurônio de cada vez.
Escolha um dos quatro dendritos CEP para avaliar blebs, quebras e irregularidades, incluindo curvas, dobras e curvas. A pontuação da esquerda para a direita quando o nariz está na parte superior da imagem é recomendada para garantir a repetibilidade na pontuação. Usando essas diretrizes, atribua um valor de pontuação a cada dendrite.
Atribua uma pontuação de zero para dendritos sem dano visível, uma pontuação de um para dendritos com irregularidades, mas sem inchaço ou quebra, uma pontuação de dois para dendritos com menos de cinco blebs, uma pontuação de três para entre cinco e 10 blebs, uma pontuação de quatro para mais de 10 blebs e/ou quebra removendo até 25% do dendrite, uma pontuação de cinco para quebra removendo 25 a 75% do dendrite, e uma pontuação de seis se mais de 75% do dendrite estiver ausente. Se vários critérios forem atendidos dentro de um único dendrite, considere os critérios correspondentes à pontuação mais alta. Estas imagens representativas de pontuação encontradas na Figura 1 do artigo associadas a este vídeo podem ser usadas como referência.
Para demonstrar pontuação, vamos caminhar através da atribuição de pontuações para alguns exemplos de imagens de neurônios. Comece com o topo mais dendrite, não há blebs visíveis, quebras ou irregularidades. Atribua uma pontuação de zero.
O segundo dendrite tem cerca de 14 blebs e nenhuma quebra visível. Atribua uma pontuação de quatro. O terceiro dendrite não pode ser visto em sua totalidade devido à sobreposição com dendrite dois e não pode ser pontuado.
O dendrite mais baixo tem cerca de 11 blebs e algumas pausas. Atribua uma pontuação de cinco. Nesta imagem, apenas três dendritos são pontuais, uma vez que um dendrito não foi totalmente capturado na captura de pilha z.
Não há blebbing nos três dendritos visíveis. Então isso seria marcado de cima para baixo como um zero, um zero, e devido à torção aqui, um. Finalmente, nesta imagem, todos os quatro dendritos estão mais de 75% perdidos.
Todos os dendritos aqui recebem uma pontuação de seis. Regisso de todas as pontuações. As pontuações podem não ter sido cegas neste momento.
O modelo de pontuação usado aqui pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares. Dividir os escores de neurodegeneração pelo número total de dendritos pontuados no grupo de tratamento. Apresentar dados como proporção de dendritos dentro do grupo de tratamento em cada escore de neurodegeneração.
Nosso sistema de pontuação foi usado para avaliar a neurodegeneração em L4 fase larval BY200 C.elegans após exposição rotenone. Os dados são apresentados aqui como com as proporções do número total de dendritos em cada valor de pontuação para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrite marcado como n 1.
Nesta figura, uma resposta de neurodegeneração dependente de dose à exposição à rotenona pode ser apreciada, e a descrição específica da distribuição de escores é exibida claramente. Esses grupos experimentais foram estatisticamente diferentes de acordo com um teste qui-quadrado para independência complementado por uma correção bonferroni para múltiplas comparações. Neste vídeo, demonstramos como usar a escala de sete pontos desenvolvida em nosso laboratório para quantificar os níveis de alteração morfológica do neurônio dopaminérgico e degeneração em C.elegans.
O uso do método de pontuação promove a consistência na análise e permite a comparação entre estudos de pesquisa de neurodegeneração em vermes. Nosso sistema de pontuação pode ser usado para analisar dados derivados de experimentos C.elegans que usam repórteres fluorescentes específicos de células, como o gene do transporte de dopamina dat-1 que permitem a visualização de neurônios dopaminérgicos. Agora, por favor, encontre um conjunto de imagens práticas com comentários que possam ser usados para treinar, calibrar e avaliar a consistência de pontuação dos pesquisadores novos neste método no material complementar deste artigo.
