Dans cette vidéo, nous montrons comment utiliser un système de notation en sept points pour quantifier les changements dans la morphologie de la dendrite des neurones dopaminergiques chez C.elegans. Il existe actuellement une grande variation dans les méthodes analytiques de quantification de la neurodégénérescence chez les vers. De plus, certaines compétences existantes se concentrent uniquement sur les corps cellulaires et ne sont pas sensibles à certains types et niveaux de dommages.
Le but de l’introduction de ce système de notation est de fournir la capacité de capturer une image complète de la neurodégénérescence à tous les niveaux de dommages, et de fournir un système universel pour soutenir la cohérence entre la recherche sur la neurodégénérescence dopaminergique de C.elegans. Ici, nous allons montrer comment imager les neurones sous fluorescence, attribuer des scores aux dendrites de ces neurones et prévisualiser comment afficher et interpréter les résultats. Pour chaque groupe expérimental, pipettez ou choisissez 20 à 30 vers vers une plateforme d’imagerie compatible avec le microscope d’imagerie.
La plupart des plates-formes courantes comprennent des coussinets d’agarose à 2% montés sur des lames de verre avec un glissement de couverture, et des plaques de 96 puits contenant des volumes de puits supérieurs ou inférieurs à 100 microlitres de milieu liquide. Laissez les vers paralyser complètement. Cela peut prendre plusieurs minutes.
Chargez la plate-forme d’imagerie préparée dans un microscope d’imagerie capable de capturer z-stack. Localisez la région de la tête du ver d’abord en champ lumineux, puis sous une fluorescence GFP couleur unique à l’aide du microscope imageur. Le ver est représenté ici dans un grossissement de 400x.
Faites défiler le focus pour trouver les limites supérieure et inférieure où les dendrites sont claires. Définissez-les comme limites supérieure et inférieure pour la capture d’image z-stack. Sélectionnez l’emplacement souhaité.
Ici, nous utilisons un micromètre. Cliquez pour capturer des images z-stack dans le canal de fluorescence GFP. Pour chaque pile z, ouvrez le fichier image à l’aide du logiciel de microscope ou d’un logiciel d’analyse d’image externe.
Chargez la pile dans le logiciel et compressez la pile en une seule image aplatie. Alignez les images entre et au sein des groupes de traitement manuellement ou à l’aide d’un logiciel d’enroulement automatique. Travaillez avec une image de neurone à la fois.
Choisissez l’une des quatre dendrites CEP à évaluer pour les blebs, les ruptures et les irrégularités, y compris les plis, les plis et les courbes. Il est recommandé de marquer de gauche à droite lorsque le nez est en haut de l’image pour assurer la répétabilité du score. À l’aide de ces instructions, attribuez une valeur de score à chaque dendrite.
Attribuer un score de zéro pour les dendrites sans dommages visibles, un score de un pour les dendrites avec irrégularités mais sans blobbing ou rupture, un score de deux pour les dendrites avec moins de cinq blebs, un score de trois pour entre cinq et 10 blebs, un score de quatre pour plus de 10 blebs et/ou bris en supprimant jusqu’à 25% de la dendrite, un score de cinq pour la casse en supprimant 25 à 75% de la dendrite, et un score de six si plus de 75% de la dendrite est absent. Si plusieurs critères sont remplis au sein d’une même dendrite, considérez les critères correspondant au score le plus élevé. Ces images de notation représentatives trouvées dans la figure 1 de l’article associé à cette vidéo peuvent être utilisées comme référence.
Pour démontrer la notation, nous allons passer en revue l’attribution de scores à quelques exemples d’images de neurones. Commencez par le plus dendrite supérieur, il n’y a pas de blebs, de cassures ou d’irrégularités visibles. Attribuez un score de zéro.
La deuxième dendrite a environ 14 blebs et aucune cassures visibles. Attribuez une note de quatre. La troisième dendrite ne peut pas être vue dans son intégralité en raison du chevauchement avec la dendrite deux et ne peut pas être notée.
La dendrite la plus en bas a environ 11 blebs et quelques cassures. Attribuez un score de cinq. Dans cette image, seules trois dendrites sont scorables, car une dendrite n’a pas été entièrement capturée dans la capture z-stack.
Il n’y a pas de blebbing sur les trois dendrites visibles. Donc, cela serait noté de haut en bas comme un zéro, un zéro, et en raison du pli ici, un. Enfin, dans cette image, les quatre dendrites sont perdues à plus de 75%.
Toutes les dendrites ici reçoivent une note de six. Enregistrez tous les scores. Les scores peuvent être sans insu pour le moment.
Le modèle de score utilisé ici se trouve dans les fichiers supplémentaires. Divisez les scores de neurodégénérescence par le nombre total de dendrites notées dans le groupe de traitement. Présenter les données en proportion de dendrites au sein du groupe de traitement à chaque score de neurodégénérescence.
Notre système de notation a été utilisé pour évaluer la neurodégénérescence au stade larvaire L4 BY200 C.elegans après une exposition à la roténone. Les données sont affichées ici avec les proportions du nombre total de dendrites à chaque valeur de score pour chaque groupe expérimental. Nous considérons chaque dendrite notée comme n 1.
Dans cette figure, une réponse de neurodégénérescence dose-dépendante à l’exposition à la roténone peut être appréciée, et la ventilation spécifique de la distribution du score est clairement affichée. Ces groupes expérimentaux étaient statistiquement différents selon un test d’indépendance du Chi carré complété par une correction de Bonferroni pour de multiples comparaisons. Dans cette vidéo, nous avons démontré comment utiliser l’échelle de sept points développée dans notre laboratoire pour quantifier les niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C.elegans.
L’utilisation de la méthode de notation favorise la cohérence dans l’analyse et permet de comparer les études de recherche sur la neurodégénérescence chez les vers. Notre système de notation peut être utilisé pour analyser les données dérivées des expériences de C.elegans qui utilisent des rapporteurs fluorescents spécifiques aux cellules, tels que le gène transporteur de dopamine dat-1 qui permet la visualisation des neurones dopaminergiques. Maintenant, veuillez trouver un ensemble pratique d’images avec des commentaires qui peuvent être utilisés pour entraîner, calibrer et évaluer la cohérence de notation des chercheurs nouveaux à cette méthode dans le matériel supplémentaire de cet article.
