В этом видео мы покажем, как использовать семиточечную систему подсчета баллов для количественной оценки изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов в C.elegans. В настоящее время существуют большие различия в аналитических методах количественной оценки нейродегенерации у червей. Кроме того, некоторые существующие навыки сосредоточены только на клеточных телах и не чувствительны к определенным типам и уровням повреждения.
Цель внедрения этой системы оценки состоит в том, чтобы обеспечить возможность захвата всеобъемлющей картины нейродегенерации на всех уровнях повреждения и обеспечить универсальную систему для поддержки согласованности в исследованиях дофаминергической нейродегенерации C.elegans. Здесь мы продемонстрируем, как визуазировать нейроны в условиях флуоресценции, присваивать оценки дендритам этих нейронов и просматривать, как отображать и интерпретировать результаты. Для каждой экспериментальной группы пипетка или кирка от 20 до 30 червей на платформе визуализации, совместимой с микроскопом визуализации.
Наиболее распространенные платформы включают 2% агарозные прокладки, установленные на стеклянных слайдах с крышкой, и 96-луночные пластины, содержащие объемы скважины на 100 микролитров жидкой среды или менее. Позвольте червям полностью парализоваться. Это может занять несколько минут.
Загрузите подготовленную платформу визуализации в микроскоп визуализации, способный захватывать z-стек. Найдите область головы червя сначала в ярком поле, а затем под одноцветной флуоресценцией GFP с помощью микроскопа визуализации. Червь показан здесь в 400-кратном увеличении.
Прокрутите фокус, чтобы найти верхнюю и нижнюю границы, где дендриты чисты. Установите их в качестве верхней и нижней границ для захвата изображений z-stack. Выберите желаемый шаг.
Здесь мы используем один микрометр. Щелкните, чтобы захватить изображения z-стека в флуоресцентном канале GFP. Для каждого z-стека откройте файл изображения с помощью программного обеспечения микроскопа или внешнего программного обеспечения для анализа изображений.
Загрузите стек в программное обеспечение и сожмите стек в одно сглаженное изображение. Выравнивание изображений между группами обработки и внутри нее вручную или с помощью программного обеспечения с автоматическим подмотом. Работайте с одним изображением нейрона за раз.
Выберите один из четырех дендритов CEP для оценки засорения, разрывов и неровностей, включая изгибы, изгибы и кривые. Оценка слева направо, когда нос находится в верхней части изображения, рекомендуется для обеспечения повторяемости при подсчете очков. Используя эти рекомендации, присвойте каждому дендриту одно значение балла.
Присвоить нулевой балл для дендритов без видимых повреждений, балл один для дендритов с неровностями, но без блобинга или поломки, счет два для дендритов с менее чем пятью блебами, балл три для от пяти до 10 блебов, счет четыре для более чем 10 блобов и / или поломки, удаляющие до 25% дендрита, пять баллов за удаление от 25 до 75% дендрита при поломке и шесть баллов, если отсутствует более 75% дендрита. Если в пределах одного дендрита выполняется несколько критериев, рассмотрите критерии, соответствующие наивысшему баллу. Эти репрезентативные изображения, найденные на рисунке 1 статьи, связанной с этим видео, могут быть использованы в качестве ссылки.
Чтобы продемонстрировать оценку, мы рассмотрим присвоение баллов нескольким примерам изображений нейронов. Начните с верхнего самого дендрита, здесь нет видимых блебов, разрывов или неровностей. Присвойте нулевой балл.
Второй дендрит имеет около 14 блебов и не имеет видимых разрывов. Присвойте балл четырем. Третий дендрит не может быть виден в полном объеме из-за перекрытия с дендритом два и не может быть оценен.
Нижний самый дендррит имеет около 11 блебов и несколько разрывов. Присвойте балл пять. На этом изображении только три дендрита поддаются оценке, так как один дендрит не был полностью захвачен в z-стеке захвата.
На трех видимых дендритах нет блеббинга. Таким образом, это будет оценено сверху донизу как ноль, ноль, и из-за излома здесь, единица. Наконец, на этом изображении все четыре дендрита потеряны более чем на 75%.
Все дендриты здесь получают оценку шесть. Запишите все партитуры. В это время оценки могут быть необольченными.
Шаблон оценки, используемый здесь, можно найти в Дополнительных файлах. Разделите подсчет баллов нейродегенерации на общее количество дендритов, набранных в группе лечения. Представлены данные в виде доли дендритов в группе лечения по каждому баллу нейродегенерации.
Наша система оценки была использована для оценки нейродегенерации в личиночной стадии L4 BY200 C.elegans после воздействия ротенона. Данные отображаются здесь как с пропорциями общего числа дендритов при каждом значении балла для каждой экспериментальной группы. Мы считаем, что каждый дендрит, оцененный как n 1.
На этом рисунке можно оценить дозозависимую реакцию нейродегенерации на воздействие ротенона, и четко отобразится специфическая разбивка распределения баллов. Эти экспериментальные группы были статистически разными в соответствии с тестом Хи-квадрат на независимость, дополненным поправкой Бонферрони для нескольких сравнений. В этом видео мы продемонстрировали, как использовать семиточечную шкалу, разработанную в нашей лаборатории, для количественной оценки уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у C.elegans.
Использование метода подсчета баллов способствует последовательности в анализе и позволяет сравнивать исследования нейродегенерации у червей. Наша система оценки может быть использована для анализа данных, полученных из экспериментов C.elegans, в которые используются специфические для клеток флуоресцентные репортеры, такие как ген переносчика дофамина dat-1, которые позволяют визуализировать дофаминергические нейроны. Теперь, пожалуйста, найдите практический набор изображений с комментариями, которые можно использовать для обучения, калибровки и оценки согласованности оценок исследователей, новичков в этом методе, в дополнительном материале этой статьи.
