이 비디오에서는 7점 채점 시스템을 사용하여 C.elegans의 도파민성 뉴런 원점 형태에 대한 변경 사항을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 현재 벌레의 신경 변성을 정량화하는 분석 방법에는 큰 변화가 있습니다. 추가적으로, 몇몇 기존 기술은 세포 바디에만 집중하고 특정 모형 및 손상의 수준에 민감하지 않습니다.
이 점수 시스템을 도입하는 목적은 모든 손상 수준에서 신경 변성의 포괄적 인 그림을 캡처할 수있는 기능을 제공하고 C.elegans 도파민신경 신경 변성 연구 전반에 걸쳐 일관성을 지원하는 보편적 인 시스템을 제공하는 것입니다. 여기에서는 형광 하에서 뉴런을 이미지화하고, 해당 뉴런의 원더라이트에 점수를 할당하고, 결과를 표시하고 해석하는 방법을 미리 볼 수 있습니다. 각 실험 군을 위해, 파이펫 또는 이미징 현미경과 호환되는 이미징 플랫폼에 20~30개의 웜을 선택한다.
가장 일반적인 플랫폼에는 커버 슬립이 있는 유리 슬라이드에 장착된 2%의 아가로즈 패드와 액체 배지 100마이크로리터 미만의 음량을 포함하는 96웰 플레이트가 있습니다. 웜이 완전히 마비되도록 허용합니다. 이 경우 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
준비된 이미징 플랫폼을 z 스택 캡처가 가능한 이미징 현미경으로 로드합니다. 화상 진찰 현미경을 사용하여 단 하나 색깔 GFP 형광의 밑에, 그 때 밝은 필드에서 먼저 벌레의 머리 영역을 찾아낸다. 웜은 400배율로 여기에 표시됩니다.
포커스를 스크롤하여 수상자가 선명한 상하 경계를 찾습니다. z 스택 이미지 캡처를 위해 상위 및 하부 경계로 설정합니다. 원하는 피치를 선택합니다.
여기서 우리는 하나의 마이크로미터를 사용합니다. GFP 형광 채널에서 z 스택 이미지를 캡처하려면 클릭합니다. 각 z 스택에 대해 현미경 소프트웨어 또는 외부 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 엽니다.
스택을 소프트웨어에 로드하고 스택을 단일 병합된 이미지로 압축합니다. 수동으로 또는 자동 권선 소프트웨어를 사용하여 치료 그룹 간에 이미지를 정렬합니다. 한 번에 하나의 뉴런 이미지로 작업할 수 있습니다.
굽힘, 꼬임 및 곡선을 포함하여 흠, 휴식 및 부정을 평가하기 위해 4개의 CEP 점자 중 하나를 선택합니다. 코가 이미지 의 맨 위에 있을 때 왼쪽에서 오른쪽으로 득점하면 점수가 반복성이 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 이 지침을 사용하여 각 점선에 하나의 점수 값을 할당합니다.
눈에 보이는 손상이없는 수상월성에 대해 0 의 점수를 할당, 부정하지만 블로빙이나 파손이없는 수상자 1 점, 5 개 미만의 흠이있는 수상월트 에 대한 점수 2 점, 5 ~ 10 blebs 사이의 3 점, 10 개 이상의 블B 및 / 또는 파손 제거의 점수는 25 %까지 제거 부진의 25~75%를 제거하고, 75% 이상이 없는 경우 6점의 점수를 제거하는 파손에 대해 5점. 단일 원점 내에서 여러 기준이 충족되는 경우 가장 높은 점수에 해당하는 기준을 고려합니다. 이 비디오와 연결된 문서의 그림 1에 있는 이러한 대표적인 점수 매기기 이미지는 참조로 사용될 수 있다.
점수를 입증하기 위해 몇 가지 예제 뉴런 이미지에 점수를 할당합니다. 맨 위 가장 원더라이트로 시작, 눈에 보이는 흠, 휴식, 또는 부정이 없습니다. 점수0을 할당합니다.
두 번째 수상자는 약 14 개의 흠과 눈에 보이는 휴식이 없습니다. 점수를 4점을 할당합니다. 세 번째 수상자는 2번 의 말단과 겹치기 때문에 전체적으로 볼 수 없으며 득점할 수 없습니다.
가장 하부 에는 약 11개의 블과 몇 번의 휴식이 있습니다. 점수를 5점을 할당합니다. 이 이미지에서는 원더라이트 한 개가 z 스택 캡처에서 완전히 캡처되지 않았기 때문에 단 3개의 수상라이트만 스콜라이트를 사용할 수 있습니다.
눈에 보이는 세 개의 수상월에는 흠이 없습니다. 그래서 이것은 0, 0으로 위에서 아래로 득점 될 것, 그리고 여기에 꼬임으로 인해, 하나. 마지막으로, 이 이미지에서는 4개의 수상월이 모두 75% 이상 손실됩니다.
여기에 모든 수상자는 여섯 점수를받을 수 있습니다. 모든 점수를 기록합니다. 점수는 현재 블라인드가 없을 수 있습니다.
여기에 사용되는 점수 템플릿은 보충 파일에서 찾을 수 있습니다. 치료 그룹에서 득점된 총 수의 담수로 신경변성 점수를 나눈다. 각 신경 변성 점수에서 치료 그룹 내의 모더릿의 비율로 데이터를 제시한다.
우리의 점수 시스템은 로테네 노출 후 L4 애벌레 단계 BY200 C.elegans에서 신경 변성을 평가하는 데 사용되었다. 데이터는 각 실험 그룹에 대한 각 점수 값의 총 점원 수의 비율과 함께 여기에 표시됩니다. 우리는 각 점선 점수를 n 1로 간주합니다.
이 그림에서, 로테네 노출에 대한 투여 의존성 신경변성 반응을 평가할 수 있고, 점수 분포의 특정 분석이 명확하게 표시됩니다. 이러한 실험 군은 여러 비교를 위한 본페로니 보정에 의해 보충된 독립을 위한 Chi-제곱 시험에 따라 통계적으로 달랐습니다. 이 비디오에서, 우리는 C.elegans에서 도파민제 뉴런 형태학적 변경 및 변성의 수준을 정량화하기 위해 실험실에서 개발 된 7 점 척도를 사용하는 방법을 보여 주었다.
채점 방법을 사용하면 분석의 일관성을 촉진하고 웜의 신경 변성 연구 연구 간의 비교를 허용합니다. 우리의 채점 시스템은 도파민 뉴런의 시각화를 허용하는 dat-1 도파민 수송 유전자와 같은 세포 별 형광 기자를 사용하는 C.elegans 실험에서 파생된 데이터를 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 지금, 훈련하는 데 사용할 수있는 해설과 이미지의 연습 세트를 찾아주세요, 보정, 이 문서의 보충 자료에서이 방법에 새로운 연구원의 점수 일관성을 평가.
