复发性流产中4种子宫内膜免疫细胞类型的多重荧光免疫组织化学染色

目前的技术允许使用在同一物种中培养的抗体来检测多达七个标记物。演示该程序的将是实验室的技术人员Loucia Chan。首先制备与组织样品一起安装的福尔马林固定石蜡嵌入载玻片，通过将载玻片平放在烤箱中，以60摄氏度烘烤，组织朝上。

一小时后，每10分钟用一系列化学物质对载玻片进行脱蜡和再水化，如手稿中所述。将载玻片浸没在tris缓冲的盐水中，然后放入装有甲醇稀释的甲醛混合物的塑料载玻片盒中，以固定样品。接下来，在去离子水中洗涤载玻片两次，持续两分钟。

通过将载玻片架置于pH 6.0下充满柠檬酸缓冲液的耐热盒中，继续进行表位检索。然后将盒子放入微波炉中，首先以100%功率加热载玻片50秒，然后以20%功率加热20分钟，以保持相同的温度。在蒸馏水中冲洗载玻片并用TBST洗涤后，将载玻片浸入含有过氧化阻断溶液的罐子中10分钟。

孵育后，用蒸馏水冲洗载玻片并用TBST洗涤，然后使用疏水屏障笔在载玻片上的组织部分周围标记边界。然后用TBST冲洗载玻片，用封闭缓冲液覆盖组织切片，并将载玻片在加湿室中孵育15分钟。要除去封闭试剂，首先用感兴趣的一抗孵育载玻片，然后通过用TBST洗涤载玻片三次来除去一抗，然后用标记的聚合物辣根过氧化物酶孵育，二抗。

孵育后，在应用用于TSA工作溶液的蛋白石菌群之前洗涤载玻片，然后用抗原取回缓冲液冲洗载玻片。通过以100%功率在微波炉中以100%功率加热抗原检索缓冲液中的载玻片50秒，然后在微波安全容器中加热20%功率20分钟，执行基于微波的剥离。在室温下冷却样品15分钟后，用蒸馏水和TBST冲洗载玻片，然后用dappy溶液孵育5分钟。

然后风干载玻片，然后用适当的安装介质安装。在对载玻片进行成像之前，请在工作站中预设相应的滤镜。捕获至少 10 个字段，以便在 200 倍放大倍率下进行分析。

要对单元格进行计数，请单击步骤栏中的"对对象进行计数"按钮，以显示对象计数设置面板。如果组织已被分割，请选择要在其中查找对象的组织类别。然后从自动刻度或固定刻度中选择所需的信号缩放。

对于对象分割，请从下拉列表中选择主组件。要将接触其他对象的对象检测为单个对象而不是组合对象，请选中最大大小和像素框，然后选择精细分割。接下来，分别计算免疫细胞中的所有基质细胞，以表示数据为免疫细胞相对于每个捕获图像的基质细胞总数的百分比。

稍后，将最终单元格计数报告为所有字段的平均值。使用视图编辑器，检查生成的数据表进行后处理，然后导出计数数据表。在代表性分析中，子宫内膜样品中的四种免疫细胞类型被分化。

处理后的图像显示组织分割为上皮和基质隔室。对一名育性对照妇女和一名不明原因复发性流产妇女的子宫内膜活检进行了多重免疫染色，在免疫染色中显示代表CD3，CD56，CD68和CD20的单层。一旦免疫声音被鉴定出来，在细胞因子下进一步染色可以帮助解决它们的相互作用和植入成功的机制。