고도로 다중화된 진동 이미징은 세포 내 분해능을 가진 조직에서 여러 단백질 마커를 조사하는 원샷 광학 접근법을 제공합니다. 이 플랫폼은 생물학적 시스템의 단백질 상호 작용에 대한 포괄적 인 그림을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 사이클이 없는 멀티플렉시입니다.
이 기술은 두꺼운 조직 절편에서와 같이 사이클링 전략이 잘 작동하지 않는 응용 분야에 특히 적합합니다. 이 방법은 조직 아틀라스 구축, 종양 미세 환경 표현형 및 프로파일링 뇌 회로와 같은 복잡한 시스템의 구조를 이해하기 위한 계내에서 개별 세포 특성화를 가능하게 한다. 시작하기 위해, 콘쥬게이션 완충제로 사용될 PHA 0.3에서 PBS 완충액에 대략 0.1몰 중탄산나트륨을 준비하고 섭씨 4도에 저장한다.
그 다음 무수 디메틸설폭사이드에서 세밀리몰 n-하이드록시숙신이미드 에스테르 함수화 MARS 프로브 용액을 준비한다. 항체 고체를 콘쥬게이션 완충액에 용해시켜 밀리리터당 두 밀리그램의 농도로 용해시킨다. 다른 완충액에 용해된 항체의 경우, 이들을 원심 필터에 농축시킨 다음, 밀리리터당 하나 내지 두 밀리그램의 농도로 콘쥬게이션 완충액에 첨가한다.
이차 항체에 대한 콘쥬게이션 반응을 수행하기 위해, 15배 몰 과량의 염료 용액을 유리 바이알에 첨가하고 교반하면서 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하면서 실온에서 인큐베이션한다. 정제를 수행하기 위해, 겔 여과 수지 분말 10 밀리리터를 50 밀리리터 튜브의 PBS 버퍼 40 밀리리터에 첨가하여 슬러리를 제조하였다. 용액을 섭씨 90도의 수조에 한 시간 동안 보관하십시오.
그런 다음 상청액을 데칸트하고, PBS를 최대 40 밀리리터까지 첨가하고, 슬러리를 섭씨 4도에서 저장한다. 크기 배제 컬럼을 슬러리 용액으로 10 내지 15 센티미터의 높이로 팩킹한 다음, 컬럼을 헹구고 대략 10 밀리리터의 PBS로 세척하여 수지를 추가로 패킹한다. 이어서, 콘쥬게이션 반응 혼합물을 컬럼에 피펫팅한다.
반응 혼합물을 로딩한 후, 즉시 용출 완충제로서 PBS 한 밀리리터를 첨가한다. 그 후, 컬럼 상의 색상을 보거나 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 콘쥬게이트 용액의 용리액을 수집한다. 원심 필터를 사용하여 수집 된 용액을 밀리리터 당 하나 ~ 두 밀리그램으로 농축하십시오.
소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그립니다. 그 다음 조직을 10분 동안 0.3 내지 0.5%PBST로 인큐베이션하고 30분 동안 블로킹 완충액으로 인큐베이션한다. 일차 염색 용액을 준비하려면, 모든 일차 항체를 원하는 농도에서 200 내지 500 마이크로리터의 염색 완충액에 첨가한다.
1차 염색액을 13, 000배 G에서 5분 동안 원심분리하고, 침전물이 나타나는 경우 상등액을 사용한다. 이어서, 조직을 일차 항체 용액에서 섭씨 네 도에서 하나 내지 이틀 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 0.3 내지 0.5%PBST로 3회 세척하고 실온에서 5분 동안 슬라이드 서있는 항아리에서 그리고 조직이 용액에 침지되었는지 확인하십시오.
이어서, 조직을 200 내지 500 마이크로리터의 블로킹 완충액에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이차 염색 용액을 준비하려면, 모든 이차 항체를 원하는 농도의 염색 완충액 200 내지 500 밀리리터에 첨가한다. 그 후 이차 염색 용액을 13, 000배 G에서 5분 동안 원심분리하고 침전물이 나타나면 상층액을 사용한다.
다음에, 조직을 섭씨 4도에서 200 내지 500 마이크로리터의 이차 항체 용액에서 하나 내지 이틀 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 0.3 내지 0.5%PBST로 각각 5분 동안 두 번 세척한다. 또한, 200 내지 500 마이크로리터의 DAPI 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션한다.
다시, 슬라이드를 실온에서 PBS로 세 번 세척하고 각각 다섯 분 동안 유리 낙하 피펫으로 부유 조직 절편을 유리 슬라이드로 옮긴다. 티슈 브러시로 티슈를 펼치고 필요한 경우 물티슈로 주변을 닦으십시오. 그런 다음 유리 커버 슬립으로 퇴색 방지 시약 한 방울에 조직을 장착하고 매니큐어로 고정하십시오.
다중 채널-eprSRS 이미징을 수행하려면 레이저 제어판에서 펌프 빔의 레이저 출력을 10 ~ 40 밀리와트로 설정하고 스토크 빔을 40 ~ 80 밀리와트로 설정하십시오. 그런 다음 픽셀 유지 시간을 2 ~ 네 마이크로 초로 설정하고 현미경 소프트웨어에서 일반적으로 평균 10 ~ 20 프레임의 여러 프레임을 사용하십시오. 또한 잠금 증폭기의 시간 상수를 픽셀 유지 시간의 절반으로 설정합니다.
뚜렷한 단백질 마커 및 HeLa 세포의 라만 염료 영상화는 파라포름알데히드-고정된 마우스 뇌 피질 및 다습한 신장 FFPE 조직을 면역 표지를 통해 수행하였다. 알파-튜불린을 사용한 HeLa 세포의 면역-eprSRS 영상화는 미세소관과 같은 미세한 세포내 구조를 드러냈다. 마우스 뇌 조직에서 MARS 2145 염색된 성상세포와 MARS 2228 염색된 소뇌 과립 뉴런의 eprSRS 영상은 세포하 분해능을 갖는 입체 패턴을 입증하였다.
동결된 마우스 췌도 조직에 대한 호르몬 및 전사 인자의 일곱 가지 컬러 SRS 형광 탠덤 이미징을 수행하였다. 획득 한 이미지는 좋은 대비와 올바른 패턴을 보여주었습니다. 파라포름알데히드-고정된 마우스 소뇌 조직 상의 세포형 마커의 여덟 가지 컬러 SRS 형광 탠덤 이미징을 수행하였다.
소뇌 과립 뉴런, 퍼킨제 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, GABAergic 뉴런과 같은 상이한 유형의 세포가 확인되었다. 이 절차는 조직 제거와 추가로 결합하여 두꺼운 손상되지 않은 조직에서 고도로 다중화 된 단백질 이미징을 수행 할 수 있습니다. 우리 그룹은 라만 염료 맞춤형 조직 제거 프로토콜을 개발했습니다.
