CRISPR-Cas9 介导在无饲养层条件下培养的人多能干细胞中的基因缺失

首先，将人胚胎干细胞悬液接种在含有 500 微升培养基的基质胶包被的 P24 孔板上。孵育过夜以允许细胞附着。第二天，以 10 的感染倍数以及每毫升 8 微克的聚凝胺感染附着的细胞。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 8 小时。孵育后，用补充有青霉素链霉素但不含岩石抑制剂的新鲜培养基替换培养基。当细胞达到 90% 汇合时，向培养基中补充每毫升 0.8 μg 嘌呤霉素以开始选择过程。

大约 4 到 6 天后，以 1 到 4 的比例分离稳定细胞并扩增它们以进行冷冻保存和进一步分析。要进行单细胞筛选，请在 10 mL 完全生长培养基中制备相当于 500 个细胞的细胞悬液。将 100 微升这种悬浮液接种到 96 孔板的每个孔中。

将细胞在培养箱中原封不动地放置三天，然后观察它们是否进一步生长。然后标记包含单个克隆的孔。每隔一天更换一次培养基并孵育，直到菌落达到足够的大小以进行进一步扩增、冷冻保存和分析，这通常需要两周时间。

首先，获得分化为神经外胚层命运的人类胚胎干细胞。当细胞达到 90% 汇合时，用 200 纳摩尔LDN193189和 10 微摩尔SB431542在 100% 敲除血清替代培养基中处理它们。最初的 24 小时后，将细胞与两微摩尔 XAV939 再孵育两天。

三天后，在 8 天内逐渐降低敲除血清替代培养基的百分比，从 75% 降至 50%，然后降至 25%，最后降至 100%N2 培养基。第 12 天，使用 Pax6 作为神经外胚层标志物固定细胞进行免疫染色。对于中胚层命运决定研究，在确定性内胚层培养基中用 3 微摩尔 CHIR 99021 处理 70% 汇合细胞 24 小时。

之后固定细胞以进行免疫染色，使用 brachyury 作为中胚层特异性标记。为了研究内胚层阶段，添加不含 CHIR 99021 的确定性内胚层培养基，并将细胞再培养 24 小时。对于拟胚体形成测定，将细胞接种在低附着细胞表面上，省略 Matrigel，以便在悬浮条件下培养它们。

与对照细胞相比，通过免疫染色确定 OCT4 、 NANOG 和 SOX2 标志物，敲除细胞系 A1 、 A5 、 B4 的多能性电位没有变化。细胞增殖标志物 KI67 的免疫染色显示，与对照相比，敲除细胞系的增殖速率没有变化。与对照相比，基因敲除细胞系的集落和拟胚体形成不受影响。

敲除细胞系 A1 、 A5 、 B4 保留了分化为三个胚层细胞的能力，通过 Pax6 、 brachyuri 和 FOXA2 标志物的免疫染色证实，与对照细胞相比，分化电位没有变化。