La dissection manuelle de l’intestin de cet élégan est une technique puissante mais simple qui permet d’étudier divers aspects de la postbiologie en isolant les tissus dans des populations spécifiques aux cellules. Cette technique de dissection tissulaire à échelle fine est facile à réaliser et utilise un équipement de laboratoire standard, ce qui en fait une méthode robuste et accessible pour beaucoup. Commencez par tirer le capillaire standard en verre standard de 4 pouces de long et de 1,2 millimètre de diamètre extérieur en forme d’aiguille d’injection à l’aide d’un extracteur d’aiguille.
Préparer au moins 5 pipettes capillaires micro de 50 et 100 micromètres. Utilisez une micro-forge pour forger les micropipettes capillaires à 50 micromètres ou 100 micromètres en cochant respectivement 3 ou 5 graduations comme indiqué par la règle oculaire micro-forge sous la lentille objectif 5X. Fixez ensuite une micro pipette capillaire sur le tube d’aspiration buccale.
Préparer un bain M9 et un bain tampon de dissection en ajoutant 2 millilitres de M9 dans une boîte de Petri stérile de 35 millimètres de diamètre et 2 millilitres de tampon de dissection à l’autre boîte de Petri stérile de 35 millimètres de diamètre. Enfin, ajoutez 100 microlitres d’albumine sérique bovine ou de solution BSA à chaque bain et mélangez-le en faisant tourbillonner. Pour préparer le réseau de dissection, ajoutez 150 microlitres de solution de lévamisole de travail au premier puits de la lame de concavité des deux puits et 150 microlitres de tampon de dissection au deuxième puits.
Ajouter 20 microlitres de solution BSA fonctionnelle à chaque puits. Pour disséquer à la main l’intestin du ver caenorhabditis elegans CL2122, déplacer 20 vers adultes du milieu de croissance des nématodes ou de la plaque NGM dans le bain M9 à l’aide d’un pic à vers. Déplacez ensuite les 20 vers du bain M9 vers le bain tampon de dissection.
Ensuite, déplacer les lots de 10 vers du bain tampon de dissection dans le puits contenant la solution de lévamisol. Une fois que le mouvement du ver ralentit, déplacez-les rapidement du puits de lévamisole au puits contenant le tampon de dissection. Laissez les vers commencer à bouger un peu dans le tampon de dissection bien avant de commencer la dissection.
Sous une lunette de dissection fluorescente, faites-en une coupe juste derrière le pharynx ou devant le rectum à l’aide d’une aiguille hypodermique pour produire un nombre égal de demi-sections antérieures et mi-postérieures de l’intestin. En attendant environ une minute pour que les intestins extrudent au maximum du corps, ajoutez 50 microlitres de tampon de chélation au puits pour aider à réduire la dégradation de l’ARN. Pour faciliter l’extrusion intestinale, utilisez la micropipette capillaire de 100 micromètres fixée à un aspirateur buccal et aspirez le ver dans et hors de la pipette.
Une fois qu’un intestin est suffisamment extrudé, utilisez l’aiguille hypodermique de calibre 27 pour le couper du reste du corps et de toute gonade restante. Aspirer la section intestinale à l’aide de la pipette microcapillaire et la transférer dans le tube microcentrifuge contenant le réactif d’isolement des acides nucléiques. Gardez les intestins isolés sur la glace et répétez la procédure pour les intestins restants.
Cette méthode a démontré la dissection et l’isolement réussis des intestins. La méthode a également rapporté l’isolement de l’ARN et la surveillance microbienne des intestins isolés. Comme les vers CL2122 hébergeaient le métal spécifique de l’intestin deux promoteurs fusionnés à la GFP, l’intestin a été observé comme une lueur verte sous la lunette de dissection fluorescente.
La dissection du ver adulte a montré un intestin extrudé après avoir fait une incision primaire juste derrière le pharynx. La dissection réussie d’un segment intestinal semblait exempte de contaminants visibles tels que des débris de la gonade ou de la carcasse. En revanche, la dissection infructueuse a montré la gonade et la carcasse attachées au segment intestinal.
Les rendements d’ARN de la dissection manuelle étaient plus efficaces car l’échantillon final de 60 sections intestinales totales a produit environ 15 nanogrammes d’ARN total de haute qualité. La désagrégation des vers et l’isolement FACS des cellules intestinales étaient moins efficaces car ceux-ci nécessitaient des centaines de milliers de cellules intestinales pour obtenir des quantités proportionnelles d’ARN total. L’amplification de l’ADN génomique microbien total à l’aide d’un test de détection panbactérien a montré que l’échantillon final de 40 sections intestinales totales des régions antérieure, moyenne et moyenne postérieure a donné la quantité faible mais détectable d’environ 0,009 picogrammes d’ADN microbien total.
La chose la plus importante à retenir lors de l’exécution de cette procédure est de ne pas trop paralyser les vers avant la dissection, car cela peut inhiber l’extrusion intestinale maximale.
