Caenorhabditis elegans 내장의 손 해부

이 엘레 간 장의 손 해부는 세포 특이 적 집단에서 조직을 분리하여 포스트 생물학의 다양한 측면을 조사 할 수있는 강력하면서도 간단한 기술입니다. 이 미세 조직 해부 기술은 수행하기 쉽고 표준 실험실 장비를 활용하므로 많은 사람들이 강력하고 접근 가능한 방법입니다. 바늘 풀러를 사용하여 길이 4인치, 외경 1.2mm의 표준 유리 모세관을 주사 바늘 모양으로 당겨 시작합니다.

최소 5 개의 50 및 100 마이크로 미터 마이크로 모세관 피펫을 준비하십시오. 마이크로 포지를 사용하여 5X 대물 렌즈 아래의 마이크로 포지 안구 눈금자에 표시된 대로 각각 3개 또는 5개의 눈금 표시를 선택하여 마이크로 모세관 피펫을 50마이크로미터 또는 100마이크로미터로 단조합니다. 그런 다음 마이크로 모세관 피펫을 구강 흡인기 튜브에 부착합니다.

직경 35mm의 멸균 페트리 접시에 M9 2밀리리터를 추가하고 다른 직경 35mm의 멸균 페트리 접시에 2밀리리터의 해부 완충액을 추가하여 M9 욕조 1개와 해부 버퍼 배스 1개를 준비합니다. 마지막으로 100 마이크로 리터의 작동 소 혈청 알부민 또는 BSA 용액을 각 욕조에 넣고 소용돌이 치면서 혼합합니다. 해부 어레이를 준비하기 위해 150 마이크로리터의 작동 레바미솔 용액을 2웰 오목한 슬라이드의 첫 번째 웰에 추가하고 150마이크로리터의 해부 완충액을 두 번째 웰에 추가합니다.

각 웰에 20마이크로리터의 작동 BSA 용액을 추가합니다. caenorhabditis elegans CL2122 벌레 장을 손으로 해부하려면 웜 픽을 사용하여 선충 성장 배지 또는 NGM 플레이트에서 M9 욕조로 20 마리의 성인 벌레를 옮깁니다. 그런 다음 20 개의 웜을 모두 M9 욕조에서 해부 버퍼 욕조로 옮깁니다.

다음으로 10 개의 웜 배치를 해부 완충 욕조에서 levamisole 용액이 포함 된 웰로 이동합니다. 웜의 움직임이 느려지면 레바미솔 웰에서 해부 완충액이 포함된 웰로 빠르게 이동합니다. 해부를 시작하기 전에 벌레가 해부 버퍼에서 약간 움직이기 시작하도록하십시오.

형광 해부 현미경 아래에서 피하 주사 바늘을 사용하여 인두 바로 뒤 또는 직장 앞에서 한 번 절단하여 장의 전방 중간 절반 및 중간 후방 절반 섹션을 동일한 수만큼 생성합니다. 장이 몸에서 최대한 돌출 될 때까지 약 1 분 동안 기다리는 동안 50 마이크로 리터의 킬레이트 화 완충액을 웰에 추가하여 RNA 분해를 줄입니다. 장 압출을 용이하게 하려면 구강 흡인기에 부착된 100마이크로미터 마이크로 모세관 피펫을 사용하고 웜을 피펫 안팎으로 끌어들입니다.

장이 충분히 압출되면 27 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 신체의 나머지 부분과 나머지 생식선에서 잘라냅니다. 마이크로 모세관 피펫을 사용하여 장 섹션을 흡인하고 핵산 분리 시약이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 격리 된 내장을 얼음 위에 놓고 나머지 내장에 대해 절차를 반복하십시오.

이 방법은 장의 성공적인 해부와 격리를 보여주었습니다. 이 방법은 또한 격리 된 장에서 RNA 분리 및 미생물 감시를보고했습니다. CL2122 웜이 GFP에 융합된 장 특이적 금속 2개의 프로모터를 보유하고 있기 때문에 형광 해부 범위 아래에서 장이 녹색 빛으로 관찰되었습니다.

성인 벌레의 해부는 인두 바로 뒤에 1 차 절개를 한 후 돌출 된 장을 보여주었습니다. 장 부분의 성공적인 해부는 생식선이나 시체의 파편과 같은 눈에 보이는 오염 물질이없는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 실패한 해부는 장 부분에 부착 된 생식선과 시체를 나타 냈습니다.

손 해부에서 얻은 RNA 수율은 총 60 개의 장 절편의 최종 샘플이 약 15 나노 그램의 고품질 총 RNA를 산출했기 때문에 더 효율적이었습니다. 장 세포의 웜 분해 및 FACS 분리는 상응하는 양의 총 RNA를 얻기 위해 수십만 개의 장 세포가 필요하기 때문에 효율성이 떨어졌습니다. 범박테리아 검출 분석을 사용한 총 미생물 게놈 DNA 증폭은 전방, 중간 및 중간 후방 영역에서 40개의 총 장 절편의 최종 샘플이 총 미생물 DNA의 약 0.009피코그램의 낮지만 검출 가능한 양을 산출했음을 보여주었습니다.

이 절차를 수행 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 최대 장 압출을 억제 할 수 있으므로 해부 전에 벌레를 과도하게 마비시키지 않는 것입니다.