Die Handdissektion dieses Elegan-Darms ist eine leistungsfähige und dennoch einfache Technik, die die Untersuchung verschiedener Aspekte der Postbiologie durch Isolierung von Gewebe in zellspezifischen Populationen ermöglicht. Diese feine Gewebedissektionstechnik ist einfach durchzuführen und verwendet Standard-Laborgeräte, was sie für viele zu einer robusten und zugänglichen Methode macht. Beginnen Sie, indem Sie die 4 Zoll lange Standardglaskapillare mit einem 1,2 Millimeter Außendurchmesser mit einem Nadelzieher in eine Injektionsnadelform ziehen.
Bereiten Sie mindestens 5 50- und 100-Mikrometer-Mikrokapillarpipetten vor. Verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Mikrokapillarpipetten entweder auf 50 Mikrometer oder 100 Mikrometer zu schmieden, indem Sie 3 bzw. 5 Häkchen ankreuzen, wie durch das Mikroschmiede-Augenlineal unter der 5X-Objektivlinse angezeigt. Befestigen Sie dann eine Mikrokapillarpipette am Mundsaugrohr.
Bereiten Sie ein M9-Bad und ein Dissektionspufferbad vor, indem Sie 2 Milliliter M9 in einer sterilen Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern und 2 Milliliter Dissektionspuffer in die andere sterile Petrischale mit 35 Millimeterdurchmesser geben. Schließlich werden 100 Mikroliter Rinderserumalbumin oder BSA-Lösung zu jedem Bad hinzugefügt und durch Schwenken gemischt. Zur Vorbereitung des Dissektionsarrays werden 150 Mikroliter Levamisollösung in die erste Vertiefung des Konkavitätsträgers der beiden Vertiefungen und 150 Mikroliter Dissektionspuffer in die zweite Vertiefung gegeben.
Fügen Sie 20 Mikroliter BSA-Arbeitslösung zu jedem Bohrloch hinzu. Um den Caenorhabditis elegans CL2122-Wurmdarm von Hand zu sezieren, bewegen Sie 20 erwachsene Würmer aus dem Nematoden-Wachstumsmedium oder der NGM-Platte mit einem Wurmpickel in das M9-Bad. Bewegen Sie dann alle 20 Würmer aus dem M9-Bad in das Dissektionspufferbad.
Als nächstes werden Chargen von 10 Würmern aus dem Dissektionspufferbad in die Vertiefung mit Levamisollösung gegeben. Sobald sich die Wurmbewegung verlangsamt, bewegen Sie sie schnell von der Levamisolmulde in die Vertiefung, die den Dissektionspuffer enthält. Lassen Sie die Würmer beginnen, sich ein wenig im Dissektionspuffer zu bewegen, bevor Sie mit der Dissektion beginnen.
Machen Sie unter einem fluoreszierenden Sezierfernrohr einen Schnitt direkt hinter dem Rachen oder vor dem Rektum mit einer Injektionsnadel, um eine gleiche Anzahl von vorderen mittleren und mittleren hinteren Halbabschnitten des Darms zu erzeugen. Während Sie etwa eine Minute warten, bis der Darm maximal aus dem Körper extrudiert ist, fügen Sie 50 Mikroliter Chelatpuffer in die Vertiefung hinzu, um den RNA-Abbau zu reduzieren. Um die Darmextrusion zu erleichtern, verwenden Sie die 100-Mikro-Mikrokapillarpipette, die an einem Mundsauger befestigt ist, und ziehen Sie den Wurm in die Pipette hinein und wieder heraus.
Sobald ein Darm ausreichend extrudiert ist, verwenden Sie die 27-Gauge-Injektionsnadel, um ihn vom Rest des Körpers und der verbleibenden Gonade abzuschneiden. Der Darmschnitt wird mit der Mikrokapillarpipette abgesaugt und in das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Nukleinsäureisolierungsreagenz überführt. Halten Sie den isolierten Darm auf Eis und wiederholen Sie den Vorgang für den verbleibenden Darm.
Diese Methode zeigte die erfolgreiche Dissektion und Isolierung des Darms. Die Methode berichtete auch über RNA-Isolierung und mikrobielle Überwachung aus isolierten Eingeweiden. Da CL2122-Würmer das darmspezifische Metall zwei Promotor beherbergten, das mit GFP verschmolzen war, wurde der Darm als grünes Leuchten unter dem fluoreszierenden Sezierfernrohr beobachtet.
Die Dissektion des erwachsenen Wurms zeigte einen extrudierten Darm nach einem primären Schnitt direkt hinter dem Pharynx. Die erfolgreiche Dissektion eines Darmabschnitts erschien frei von sichtbaren Verunreinigungen wie Ablagerungen von der Gonade oder dem Kadaver. Im Gegensatz dazu zeigte die erfolglose Dissektion die Gonade und den Kadaver, die am Darmsegment befestigt waren.
Die RNA-Ausbeuten aus der Handdissektion waren effizienter, da die endgültige Probe von insgesamt 60 Darmabschnitten etwa 15 Nanogramm hochwertige Gesamt-RNA ergab. Die Wurmdisaggregation und FACS-Isolierung von Darmzellen war weniger effizient, da diese Hunderttausende von Darmzellen benötigten, um entsprechende Mengen an Gesamt-RNA zu erhalten. Die gesamte mikrobielle genomische DNA-Amplifikation mit einem panbakteriellen Nachweistest zeigte, dass die endgültige Probe von 40 gesamten Darmabschnitten aus den vorderen, mittleren und mittleren posterioren Regionen die geringe, aber nachweisbare Menge von etwa 0,009 Pikogramm gesamtmikrobieller DNA ergab.
Das Wichtigste, woran Sie sich bei der Durchführung dieses Verfahrens erinnern sollten, ist, die Würmer vor der Dissektion nicht übermäßig zu lähmen, da dies die maximale Darmextrusion hemmen kann.
