Bu elegan'ın bağırsağının el diseksiyonu, hücreye özgü popülasyonlarda dokuyu izole ederek post biyolojinin çeşitli yönlerinin araştırılmasını sağlayan güçlü ama basit bir tekniktir. Bu ince ölçekli doku diseksiyon tekniğinin uygulanması kolaydır ve standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır, bu da onu birçok kişi için sağlam ve erişilebilir bir yöntem haline getirir. 4 inç uzunluğunda ve 1,2 milimetre dış çaplı standart cam kılcal damarı bir iğne çektirme makinesi kullanarak enjeksiyon iğnesi şekline çekerek başlayın.
En az 5 adet 50 ve 100 mikrometre mikro kılcal pipet hazırlayın. Mikro kılcal pipetleri, 5X objektif lensin altındaki mikro dövme oküler cetvel tarafından belirtildiği gibi sırasıyla 3 veya 5 onay işaretini işaretleyerek 50 mikrometre veya 100 mikrometreye dövmek için bir mikro dövme makinesi kullanın. Daha sonra ağız aspiratör tüpüne mikro kılcal bir pipet yapıştırın.
35 milimetre çapında steril Petri kabına 2 mililitre M9 ve diğer 35 milimetre çaplı steril Petri kabına 2 mililitre diseksiyon tamponu ekleyerek bir M9 banyosu ve bir diseksiyon tampon banyosu hazırlayın. Son olarak, her banyoya 100 mikrolitre çalışan sığır serum albümini veya BSA çözeltisi ekleyin ve döndürerek karıştırın. Diseksiyon dizisini hazırlamak için, iki kuyu konkavite sürgüsünün ilk kuyucuğuna 150 mikrolitre çalışma levamisol çözeltisi ve ikinci kuyucuğa 150 mikrolitre diseksiyon tamponu ekleyin.
Her bir kuyucuğa 20 mikrolitre çalışan BSA çözeltisi ekleyin. Caenorhabditis elegans CL2122 solucan bağırsağını elle incelemek için, 20 yetişkin solucanı nematod büyüme ortamından veya NGM plakasından bir solucan toplama kullanarak M9 banyosuna taşıyın. Ardından 20 solucanın tümünü M9 banyosundan diseksiyon tampon banyosuna taşıyın.
Daha sonra 10 solucan partilerini diseksiyon tampon banyosundan levamisol çözeltisi içeren kuyuya taşıyın. Solucan hareketi yavaşladığında, onları levamisol kuyucuğundan diseksiyon tamponunu içeren kuyuya hızla hareket ettirin. Diseksiyona başlamadan önce solucanların diseksiyon tamponunda biraz hareket etmeye başlamasına izin verin.
Bir floresan diseksiyon kapsamı altında, bağırsağın eşit sayıda ön orta yarı ve orta arka yarım bölümünü üretmek için hipodermik bir iğne kullanarak farenksin hemen arkasında veya rektumun önünde bir kesim yapın. Bağırsakların vücuttan maksimum ekstrüzyon yapması için yaklaşık bir dakika beklerken, RNA bozulmasını azaltmaya yardımcı olmak için kuyucuğa 50 mikrolitre şelatasyon tamponu ekleyin. Bağırsak ekstrüzyonunu kolaylaştırmak için ağız aspiratörüne bağlı 100 mikrometre mikro kılcal pipeti kullanın ve solucanı pipetin içine ve dışına çekin.
Bir bağırsak yeterince ekstrüde edildikten sonra, vücudun geri kalanından ve kalan gonaddan kesmek için 27 gauge hipodermik iğneyi kullanın. Mikro kılcal pipeti kullanarak bağırsak bölümünü aspire edin ve nükleik asit izolasyon reaktifi içeren mikro santrifüj tüpüne aktarın. İzole bağırsakları buz üzerinde tutun ve kalan bağırsaklar için prosedürü tekrarlayın.
Bu yöntemle bağırsakların başarılı diseksiyonu ve izolasyonu gösterilmiştir. Yöntem ayrıca izole bağırsaklardan RNA izolasyonu ve mikrobiyal sürveyans bildirdi. CL2122 solucanları, GFP'ye kaynaşmış bağırsağa özgü metal iki promotörü barındırdığından, bağırsak, floresan diseksiyon kapsamı altında yeşil bir parıltı olarak gözlendi.
Yetişkin solucanın diseksiyonu, farenksin hemen arkasında birincil bir kesi yapıldıktan sonra ekstrüde bir bağırsak gösterdi. Bir bağırsak segmentinin başarılı diseksiyonu, gonad veya karkastan gelen döküntüler gibi görünür kirleticilerden arındırılmış olarak ortaya çıktı. Buna karşılık, başarısız diseksiyon, bağırsak segmentine bağlı gonad ve karkası gösterdi.
El diseksiyonundan elde edilen RNA verimleri daha verimliydi, çünkü 60 toplam bağırsak kesitinin son örneği kabaca 15 nanogram yüksek kaliteli toplam RNA verdi. Bağırsak hücrelerinin solucan ayrışması ve FACS izolasyonu daha az verimliydi, çünkü bunlar orantılı miktarlarda toplam RNA elde etmek için yüz binlerce bağırsak hücresi gerektiriyordu. Bir pan-bakteriyel tespit testi kullanılarak yapılan toplam mikrobiyal genomik DNA amplifikasyonu, ön, orta ve orta arka bölgelerden 40 toplam bağırsak kesitinin son örneğinin, toplam mikrobiyal DNA'nın yaklaşık 0.009 pikogramının düşük ancak tespit edilebilir miktarını verdiğini göstermiştir.
Bu prosedürü uygularken hatırlanması gereken en önemli şey, diseksiyondan önce solucanları aşırı felç etmemektir, çünkü bu maksimum bağırsak ekstrüzyonunu engelleyebilir.
