磷酸化RIPK3和MLKL的稳健可视化是坏死性凋亡诱导过程中的两个关键信号事件，在技术上具有挑战性。所提出的酪酰胺扩增方案能够灵敏地检测这两种分子。信号放大步骤降低了检测阈值，允许对磷酸化的RIPK3和MLKL进行稳健且可重复的检测。
开始将 90， 000 个表达 ZBP1 的 HT-29 细胞接种在全强度 McCoy 的 5A 培养基中，置于 1 厘米见方表面积的孔板中，允许高端显微镜检查。每孔使用200微升的结束体积。将细胞在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育过夜。
一旦细胞达到70%至80%汇合度，在含有单纯疱疹病毒一的200微升预热的全强度McCoy's 5A培养基中感染细胞，以5的感染倍数编码边缘突变体ICP6。将细胞与病毒孵育九小时以诱导坏死性凋亡。作为坏死性凋亡诱导的阳性对照，用200微升预热的坏死性凋亡诱导鸡尾酒刺激细胞四小时。
作为阴性对照，加入22微升10微摩尔GSK840预热37摄氏度以抑制RIPK3激酶活性。在未经治疗的条件下和坏死性凋亡刺激后包括该抑制剂，以防止丝氨酸227的自磷酸化。要固定细胞，请取出培养基并用200微升PBS洗涤细胞。
然后取出PBS，加入150微升在室温下平衡的4%多聚甲醛。将细胞在室温下孵育30分钟。固定后，除去4%多聚甲醛，用200微升PBS洗涤细胞三次。
样品可以在超过PBS的4摄氏度下储存过夜，直到进一步处理。从平板上取出PBS，并在室温下将细胞与100微升渗透缓冲液在倾斜的实验室振荡器上孵育30分钟。孵育后，除去透化缓冲液，并用100微升洗涤缓冲液洗涤细胞。
将成像室与洗涤缓冲液在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育五分钟。为防止一抗的非特异性结合，请将板与100微升封闭培养基在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育两小时。接下来，用100微升洗涤缓冲液洗涤孔三次，在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育五分钟。
除去洗涤缓冲液后，向成像室中加入100微升一抗。确保包括无一抗条件，以可视化酪胺信号放大的潜在背景，并设置掩蔽阈值。将腔室在四摄氏度下孵育过夜。
除去一抗混合物，并用100微升洗涤缓冲液洗涤孔三次，在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育5分钟。去除洗涤缓冲液后，用100微升HRP标记的二抗孵育细胞，识别要在倾斜的实验室摇床上扩增30分钟的一抗种类。在抗体孵育期间，制备生物素化酪胺混合物。
为了触发HRP的酶活性，请在使用前将氧化底物新鲜添加到TSA缓冲液中。然后使用优化的稀释液在制备的TSA缓冲液中稀释生物素化的酪胺。用HRP标记的二抗孵育后，用洗涤缓冲液洗涤孔三次，在倾斜的实验室摇床上孵育五分钟。
从孔中取出洗涤缓冲液后，向孔中加入稀释的生物素 - 酪胺至100微升的结束体积。在室温下在倾斜的实验室摇床上孵育反应10分钟，然后进行三次洗涤缓冲液洗涤。制备含有二抗、偶联链霉亲和素和核染色和洗涤缓冲液的染色混合物。
取出洗涤缓冲液，并在室温下将板与100微升染色混合物在倾斜的实验室摇床上孵育一小时。从此步骤开始，保持成像室免受光线照射。染色后，用洗涤缓冲液连续洗涤两次，并用PBS冲洗孔两次。
将超过PBS的样品储存在4摄氏度下，以保存染色直至成像。成像室现在可以在共聚焦显微镜上可视化。酪胺信号扩增的加入能够可靠地检测编码边缘突变体ICP6感染细胞的单纯疱疹病毒1的细胞质中丝氨酸227处磷酸化的RIPK3。
2%的激光功率足以进行灵敏检测。在标准的间接免疫荧光中，较高的激光功率仍然不足以检测磷酸化-RIPK3。在三维Z-stack图像的定量中，感染细胞显示磷酸化RIPK3阳性体素比模拟处理的细胞增加约20倍。
与模拟处理的细胞相比，野生型单纯疱疹病毒一感染细胞的磷酸化RIPK3染色增加表明ICP6的边缘结构域无法完全阻断丝氨酸227处的RIPK3磷酸化。GSK840与RIPK3的激酶结构域结合，并在ZBP1激活时阻止丝氨酸227处的RIPK3磷酸化，证实了酪胺信号放大介导的磷酸化RIPK3检测方法的特异性。模拟处理的细胞在丝氨酸358处的MLKL磷酸化略微间断的胞质染色较低，而在感染细胞的细胞质，细胞核和质膜中检测到强染色。
标准的间接免疫荧光需要40%的激光功率来特异性检测感染细胞中的磷酸化MLKL信号。相比之下，酪胺信号放大提高了磷酸化MLKL的检测灵敏度，从而将必要的激光功率降低到6%3D Z-stack图像量化显示，与使用标准方法相比，使用酪胺信号放大的磷酸化MLKL阳性体素数量增加了约90倍，这表明磷酸化MLKL的检测阈值和灵敏度有所提高。与单纯疱疹病毒类似，甲型流感病毒感染引发ZBP1依赖性坏死性凋亡。
酪胺信号放大允许对磷酸化-RIPK3和磷酸化-MLKL进行稳健的检测，表明坏死性凋亡。为了解释共聚焦染色，需要包括几个染色对照。这需要无原发条件、单一染色以及阳性对照。
通过调整该协议，可以使用顺序TSA扩增多个靶标。这将允许在同一细胞内检测磷酸化的RIPK3和MLKL。对坏死性凋亡生物标志物的灵敏检测对于正在进行的关于自身炎症或病毒感染的ZBP1研究具有洞察力，在这些研究中，执行的ZBP1依赖性细胞死亡途径仍需要确认为坏死性凋亡，细胞凋亡或焦亡。
