A visualização robusta de RIPK3 e MLKL fosforilados, dois eventos-chave de sinalização durante a indução da necroptose, tem sido tecnicamente desafiadora. O protocolo de amplificação de tiramida apresentado permite a detecção sensível dessas duas moléculas. A etapa de amplificação do sinal reduz o limiar de detecção, permitindo a detecção robusta e reprodutível de RIPK3 e MLKL fosforilados.
Comece a semear as 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy de força total em uma placa de poço de área de superfície quadrada de um centímetro, permitindo microscopia de ponta. Use um volume final de 200 microlitros por poço. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.
Uma vez que as células atinjam 70 a 80% de confluência, infecte as células em 200 microlitros pré-aquecidos, meio McCoy's 5A de força total contendo o vírus herpes simplex um, codificando uma ICP6 mutante de borda a uma multiplicidade de infecção de cinco. Incubar as células com o vírus por nove horas para induzir necroptose. Como controle positivo para a indução de necroptose, estimular as células por quatro horas com 200 microlitros de coquetel indutor de necroptose pré-aquecido.
Como controle negativo, adicione 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 pré-aquecidos a 37 graus Celsius para inibir a atividade da quinase RIPK3. Incluir este inibidor em uma condição não tratada e após estimulação da necroptose para evitar a autofosforilação da serina 227. Para fixar as células, retire o meio e lave as células com 200 microlitros de PBS.
Em seguida, retire o PBS e adicione 150 microlitros de paraformaldeído a 4% equilibrado à temperatura ambiente. Incubar as células à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a fixação, retire o paraformaldeído a 4% e lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS.
As amostras podem ser armazenadas em excesso de PBS a quatro graus Celsius durante a noite até processamento adicional. Remova o PBS da placa e incube as células com 100 microlitros de tampão de permeação à temperatura ambiente por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Após a incubação, remova o tampão de permeabilização e lave as células com 100 microlitros de tampão de lavagem.
Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem durante cinco minutos à temperatura ambiente num agitador de laboratório inclinado. Para evitar a ligação inespecífica de anticorpos primários, incubar a placa com 100 microlitros de meio bloqueador à temperatura ambiente por duas horas em um agitador de laboratório inclinado. Em seguida, lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
Depois de remover o tampão de lavagem, adicione 100 microlitros dos anticorpos primários à câmara de imagem. Certifique-se de incluir uma condição de anticorpo não primária para visualizar o fundo potencial da amplificação do sinal de tiramida e definir o limiar de mascaramento. Incubar a câmara durante a noite a quatro graus Celsius.
Remova a mistura primária de anticorpos e lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado. Após a remoção do tampão de lavagem, incubar as células com 100 microlitros de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies do anticorpo primário a serem amplificadas por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Durante a incubação de anticorpos, prepare a mistura de tiramida biotinilada.
Para desencadear a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante ao tampão TSA imediatamente antes do uso. Em seguida, diluir a tiramida biotinilada no tampão TSA preparado utilizando a diluição optimizada. Após a incubação com anticorpo secundário marcado com HRP, lave os poços três vezes com tampão de lavagem com cinco minutos de incubação em um agitador de laboratório inclinado.
Depois de remover o tampão de lavagem do poço, adicione biotina-tiramida diluída ao poço a um volume final de 100 microlitros. Incubar a reação à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado, seguido de três lavagens tampão de lavagem. Prepare a mistura de coloração contendo o anticorpo secundário, a estreptavidina acoplada e o tampão de coloração e lavagem nuclear.
Retire o tampão de lavagem e incube a placa com 100 microlitros de mistura de coloração à temperatura ambiente durante uma hora num agitador de laboratório basculante. Mantenha as câmaras de imagem protegidas da luz a partir deste passo. Após a coloração, lave consecutivamente duas vezes com tampão de lavagem e enxágue os poços duas vezes com PBS.
Armazenar as amostras em excesso de PBS a quatro graus Celsius para preservar a coloração até a imagem. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal. A inclusão da amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de RIPK3 fosforilado na serina 227 no citosol do vírus herpes simplex um, codificando uma borda mutante de células infectadas por ICP6.
Uma potência do laser de 2% foi suficiente para a detecção sensível. Na imunofluorescência indireta padrão, uma maior potência do laser permaneceu insuficiente para a detecção de fosfo-RIPK3. Na quantificação das imagens tridimensionais da pilha Z, as células infectadas mostraram um aumento de aproximadamente 20 vezes de voxels positivos para RIPK3 fosforilado em relação às células tratadas simuladas.
O aumento da coloração fosfo-RIPK3 de células infectadas pelo vírus herpes simplex do tipo selvagem em comparação com células tratadas simuladas indicou que o domínio da borda da ICP6 é incapaz de bloquear completamente a fosforilação da RIPK3 na serina 227. O GSK840 liga-se ao domínio da quinase de RIPK3 e impede a fosforilação de RIPK3 na serina 227 após a ativação do ZBP1, confirmando a especificidade do método de detecção de fosfo-RIPK3 mediado por amplificação de sinal de tiramida. As células tratadas simuladas apresentaram baixa coloração citosólica levemente pontuada de fosforilação MLKL na serina 358, enquanto forte coloração foi detectada no citosol, núcleo e membrana plasmática das células infectadas.
A imunofluorescência indireta padrão exigiu 40% de potência laser para a detecção específica de um sinal fosfo-MLKL nas células infectadas. Em contraste, a amplificação do sinal de tiramida aumentou a sensibilidade de detecção de fosfo-MLKL, diminuindo assim a potência necessária do laser para 6% de quantificação de imagem de pilha Z 3D mostrou um aumento de aproximadamente 90 vezes no número de voxels positivos para fosfo-MLKL usando amplificação de sinal de tiramida, em comparação com um aumento de sete vezes usando o método padrão, indicando melhor limiar de detecção e sensibilidade para fosfo-MLKL. Semelhante ao vírus herpes simplex um, a infecção pelo vírus influenza A desencadeou necroptose dependente de ZBP1.
A amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de fosfo-RIPK3 e fosfo-MLKL, indicando necroptose. Para interpretar a coloração confocal, vários controles de coloração precisam ser incluídos. Isso implica uma condição sem primária, manchas únicas, bem como um controle positivo.
Ao adaptar este protocolo, vários alvos podem ser amplificados usando TSA sequencial. Isso permitiria a detecção de RIPK3 e MLKL fosforilados dentro da mesma célula. A detecção sensível de biomarcadores de necroptose pode ser perspicaz para pesquisas em andamento sobre ZBP1 sobre autoinflamação ou infecção por vírus, nas quais as vias de morte celular dependentes de ZBP1 executadas ainda precisam ser confirmadas como necroptose, apoptose ou piroptose.
