La visualización robusta de RIPK3 y MLKL fosforiladas, dos eventos de señalización clave durante la inducción de necroptosis, ha sido técnicamente desafiante. El protocolo de amplificación de tiramida presentado permite la detección sensible de estas dos moléculas. El paso de amplificación de la señal reduce el umbral de detección, lo que permite una detección robusta y reproducible de RIPK3 y MLKL fosforilados.
Comience a sembrar las 90, 000 células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy de fuerza completa en una placa de pozo de área de superficie cuadrada de un centímetro, lo que permite una microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 microlitros por pozo. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Una vez que las células alcanzan el 70 al 80% de confluencia, infectar las células en 200 microlitros precalentados, medio McCoy's 5A de fuerza completa que contiene el virus del herpes simple uno, codificando un borde mutante ICP6 en una multiplicidad de infección de cinco. Incubar las células con el virus durante nueve horas para inducir necroptosis. Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimule las células durante cuatro horas con 200 microlitros de cóctel precalentado que induce necroptosis.
Como control negativo, agregue 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 precalentados a 37 grados centígrados para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3. Incluya este inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de necroptosis para prevenir la autofosforilación de la serina 227. Para fijar las células, retire el medio y lave las células con 200 microlitros de PBS.
Luego retire el PBS y agregue 150 microlitros de paraformaldehído al 4% equilibrado a temperatura ambiente. Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la fijación, retire el 4% de paraformaldehído y lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS.
Las muestras se pueden almacenar en exceso de PBS a cuatro grados centígrados durante la noche hasta su posterior procesamiento. Retire el PBS de la placa e incube las células con 100 microlitros de tampón de permeación a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Después de la incubación, retire el tampón de permeabilización y lave las células con 100 microlitros de tampón de lavado.
Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Para evitar la unión no específica de anticuerpos primarios, incube la placa con 100 microlitros de medio de bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas en un agitador de laboratorio basculante. A continuación, lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.
Después de retirar el tampón de lavado, agregue 100 microlitros de anticuerpos primarios a la cámara de imágenes. Asegúrese de incluir una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial de la amplificación de la señal de tiramida y establecer el umbral de enmascaramiento. Incubar la cámara durante la noche a cuatro grados centígrados.
Retire la mezcla primaria de anticuerpos y lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Después de retirar el tampón de lavado, incubar las células con 100 microlitros de anticuerpo secundario marcado con HRP, reconociendo la especie del anticuerpo primario que se amplificará durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Durante la incubación de anticuerpos, prepare la mezcla de tiramida biotinilada.
Para desencadenar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante al tampón TSA antes de usarlo. A continuación, diluir la tiramida biotinilada en el tampón TSA preparado utilizando la dilución optimizada. Después de la incubación con anticuerpos secundarios marcados con HRP, lave los pocillos tres veces con tampón de lavado con cinco minutos de incubación en un agitador de laboratorio basculante.
Después de retirar el tampón de lavado del pozo, agregue biotina-tiramida diluida al pozo hasta un volumen final de 100 microlitros. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante, seguido de tres lavados tampón. Prepare la mezcla de tinción que contiene el anticuerpo secundario, la estreptavidina acoplada y la tinción nuclear y el tampón de lavado.
Retire el tampón de lavado e incube la placa con 100 microlitros de mezcla de tinción a temperatura ambiente durante una hora en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga las cámaras de imágenes protegidas de la luz desde este paso en adelante. Después de la tinción, lave consecutivamente dos veces con tampón de lavado y enjuague los pocillos dos veces con PBS.
Almacene las muestras en exceso de PBS a cuatro grados centígrados para preservar la tinción hasta la obtención de imágenes. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal. La inclusión de la amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de RIPK3 fosforilada en serina 227 en el citosol del virus del herpes simple uno que codifica una célula infectada con ICP6 mutante en el borde.
Una potencia láser del 2% fue suficiente para la detección sensible. En la inmunofluorescencia indirecta estándar, una mayor potencia láser seguía siendo insuficiente para la detección de fosfo-RIPK3. En la cuantificación de las imágenes tridimensionales de la pila Z, las células infectadas mostraron un aumento de aproximadamente 20 veces de vóxeles positivos para RIPK3 fosforilada sobre células tratadas simuladamente.
El aumento de la tinción fosfo-RIPK3 de las células infectadas con el virus del herpes simple de tipo salvaje en comparación con las células tratadas con simulacros indicó que el dominio del borde de ICP6 no puede bloquear completamente la fosforilación de RIPK3 en serina 227. GSK840 se une al dominio quinasa de RIPK3 y previene la fosforilación de RIPK3 en la serina 227 tras la activación de ZBP1, confirmando la especificidad del método de detección de fosfo-RIPK3 mediado por amplificación de señal de tiramida. Las células tratadas simuladas mostraron una tinción citosólica baja ligeramente puntuada de la fosforilación de MLKL en la serina 358, mientras que se detectó una fuerte tinción en el citosol, el núcleo y la membrana plasmática de las células infectadas.
La inmunofluorescencia indirecta estándar requirió una potencia láser del 40% para la detección específica de una señal de fosfo-MLKL en las células infectadas. Por el contrario, la amplificación de la señal de tiramida aumentó la sensibilidad de detección de fosfo-MLKL, reduciendo así la potencia láser necesaria al 6%La cuantificación de la imagen de la pila Z 3D mostró un aumento de aproximadamente 90 veces en el número de vóxeles positivos para fosfo-MLKL utilizando amplificación de señal de tiramida, en comparación con un aumento de siete veces utilizando el método estándar, lo que indica un umbral de detección mejorado y sensibilidad para fosfo-MLKL. Similar al virus del herpes simple uno, la infección por el virus de la influenza A desencadenó necroptosis dependiente de ZBP1.
La amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de fosfo-RIPK3 y fosfo-MLKL, lo que indica necroptosis. Para interpretar la tinción confocal, se deben incluir varios controles de tinción. Esto implica una condición no primaria, manchas individuales, así como un control positivo.
Al adaptar este protocolo, se pueden amplificar múltiples objetivos utilizando TSA secuencial. Esto permitiría la detección de RIPK3 y MLKL fosforilados dentro de la misma célula. La detección sensible de biomarcadores de necroptosis puede ser reveladora para la investigación en curso de ZBP1 sobre autoinflamación o infección por virus en la que las vías de muerte celular dependientes de ZBP1 ejecutadas aún deben confirmarse como necroptosis, apoptosis o piroptosis.
