Die robuste Visualisierung von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL, zwei wichtigen Signalereignissen während der Nekroptose-Induktion, war eine technische Herausforderung. Das vorgestellte Tyramid-Amplifikationsprotokoll ermöglicht einen sensitiven Nachweis dieser beiden Moleküle. Der Signalverstärkungsschritt senkt die Detektionsschwelle und ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Detektion von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL.
Beginnen Sie mit der Aussaat der 90.000 ZBP1-exprimierenden HT-29-Zellen im 5A-Medium von McCoy in voller Stärke in einer Vertiefungsplatte mit einer Fläche von einem Zentimeter, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Sobald die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, infizieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern vorgewärmtem, vollwertigem McCoy's 5A-Medium, das Herpes-simplex-Virus eins enthält und eine Randmutante ICP6 bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf kodiert. Inkubieren Sie die Zellen neun Stunden lang mit dem Virus, um eine Nekroptose zu induzieren. Als Positivkontrolle für die Nekroptose-Induktion stimulieren Sie die Zellen vier Stunden lang mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Nekroptose-induzierenden Cocktail.
Als Negativkontrolle fügen Sie 22 Mikroliter 10 Mikromolare GSK840 hinzu, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind, um die RIPK3-Kinaseaktivität zu hemmen. Schließen Sie diesen Inhibitor in einem unbehandelten Zustand und nach Nekroptosestimulation ein, um die Autophosphorylierung von Serin 227 zu verhindern. Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern PBS.
Dann entfernen Sie das PBS und fügen Sie 150 Mikroliter 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Fixierung die 4% Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS.
Die Proben können über PBS bei vier Grad Celsius über Nacht bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden. Entfernen Sie das PBS von der Platte und inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Permeationspuffer bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborshaker. Entfernen Sie nach der Inkubation den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer.
Inkubieren Sie die Bildgebungskammer mit Waschpuffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker. Um die unspezifische Bindung von primären Antikörpern zu verhindern, inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Blockmedium bei Raumtemperatur für zwei Stunden auf einem kippbaren Laborschüttler. Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker.
Nach dem Entfernen des Waschpuffers 100 Mikroliter der primären Antikörper in die Bildgebungskammer geben. Stellen Sie sicher, dass keine primäre Antikörperbedingung enthalten ist, um den potenziellen Hintergrund der Tyramidsignalverstärkung zu visualisieren und die Maskierungsschwelle festzulegen. Die Kammer über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler. Nach dem Entfernen des Waschpuffers inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern HRP-markiertem sekundären Antikörper und erkennen Sie die Spezies des primären Antikörpers, die für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler amplifiziert werden sollen. Während der Antikörperinkubation die biotinylierte Tyramidmischung vorbereiten.
Um die enzymatische Aktivität von HRP auszulösen, fügen Sie dem TSA-Puffer vor Gebrauch frisch ein oxidierendes Substrat hinzu. Anschließend wird das biotinylierte Tyramid im vorbereiteten TSA-Puffer unter Verwendung der optimierten Verdünnung verdünnt. Nach der Inkubation mit HRP-markierten sekundären Antikörpern waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation auf einem kippbaren Laborschüttler.
Nach dem Entfernen des Waschpuffers aus der Vertiefung wird verdünntes Biotin-Tyramid zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern in die Vertiefung gegeben. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler, gefolgt von drei Waschpufferwäschen. Bereiten Sie die Färbemischung vor, die den sekundären Antikörper, gekoppeltes Streptavidin und Kernfärbung und Waschpuffer enthält.
Entfernen Sie den Waschpuffer und inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Färbemischung bei Raumtemperatur für eine Stunde auf einem kippbaren Laborschüttler. Halten Sie die Bildkammern ab diesem Schritt lichtgeschützt. Nach dem Färben zweimal nacheinander mit Waschpuffer waschen und die Vertiefungen zweimal mit PBS abspülen.
Lagern Sie die Proben über PBS hinaus bei vier Grad Celsius, um die Färbung bis zur Bildgebung zu erhalten. Die Bildgebungskammer kann nun auf einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Die Einbeziehung der Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von RIPK3, das an Serin 227 im Zytosol des Herpes-simplex-Virus one phosphoryliert wurde, das für eine mit der Felgenmutante ICP6 infizierte Zellen kodiert.
Eine Laserleistung von 2% war für die empfindliche Detektion ausreichend. Bei der indirekten Standard-Immunfluoreszenz reichte eine höhere Laserleistung für den Nachweis von Phospho-RIPK3 nicht aus. Bei der Quantifizierung der dreidimensionalen Z-Stack-Bilder zeigten die infizierten Zellen einen etwa 20-fachen Anstieg der Voxel, die positiv für phosphoryliertes RIPK3 waren, gegenüber pseudobehandelten Zellen.
Eine erhöhte Phospho-RIPK3-Färbung von Wildtyp-Herpes-simplex-Virus-eins-infizierten Zellen im Vergleich zu nachgebildeten behandelten Zellen zeigte, dass die Randdomäne von ICP6 nicht in der Lage ist, die RIPK3-Phosphorylierung an Serin 227 vollständig zu blockieren. GSK840 bindet an die Kinasedomäne von RIPK3 und verhindert die RIPK3-Phosphorylierung bei Serin 227 nach ZBP1-Aktivierung, was die Spezifität der Tyramid-Signalamplifikations-vermittelten Phospho-RIPK3-Detektionsmethode bestätigt. Die simulierten Zellen zeigten eine geringe leicht punktierte zytosolische Färbung der MLKL-Phosphorylierung bei Serin 358, während eine starke Färbung im Zytosol, im Zellkern und in der Plasmamembran der infizierten Zellen nachgewiesen wurde.
Die standardmäßige indirekte Immunfluoreszenz benötigte 40% Laserleistung für den spezifischen Nachweis eines Phospho-MLKL-Signals in den infizierten Zellen. Im Gegensatz dazu erhöhte die Tyramid-Signalverstärkung die Detektionsempfindlichkeit von Phospho-MLKL, wodurch die erforderliche Laserleistung auf 6% gesenkt wurde. Die 3D-Z-Stack-Bildquantifizierung zeigte einen etwa 90-fachen Anstieg der Anzahl der Voxel, die mit Tyramid-Signalverstärkung positiv für Phospho-MLKL waren, verglichen mit einer siebenfachen Erhöhung mit der Standardmethode, was auf eine verbesserte Nachweisschwelle und Empfindlichkeit für Phospho-MLKL hinweist. Ähnlich wie Herpes-simplex-Virus löste die Influenza-A-Virusinfektion eine ZBP1-abhängige Nekroptose aus.
Die Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von Phospho-RIPK3 und Phospho-MLKL, was auf eine Nekroptose hindeutet. Um die konfokale Färbung zu interpretieren, müssen mehrere Färbekontrollen einbezogen werden. Dies beinhaltet eine keine primäre Bedingung, einzelne Flecken sowie eine Positivkontrolle.
Durch die Anpassung dieses Protokolls können mehrere Ziele mithilfe sequentieller TSA verstärkt werden. Dies würde den Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL innerhalb derselben Zelle ermöglichen. Der empfindliche Nachweis von Nekroptose-Biomarkern kann für die laufende ZBP1-Forschung zu Autoinflammation oder Virusinfektion aufschlussreich sein, bei der die ausgeführten ZBP1-abhängigen Zelltodwege noch als Nekroptose, Apoptose oder Pyroptose bestätigt werden müssen.
