La visualizzazione robusta di RIPK3 e MLKL fosforilati, due eventi di segnalazione chiave durante l'induzione della necroptosi, è stata tecnicamente impegnativa. Il protocollo di amplificazione della tiramido presentato consente il rilevamento sensibile di queste due molecole. La fase di amplificazione del segnale abbassa la soglia di rilevamento, consentendo un rilevamento robusto e riproducibile di RIPK3 e MLKL fosforilati.
Inizia a seminare le 90.000 cellule HT-29 che esprimono ZBP1 nel mezzo 5A di McCoy a piena forza in una piastra di superficie di un centimetro quadrato, consentendo la microscopia di fascia alta. Utilizzare un volume finale di 200 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Una volta che le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, infettare le cellule in 200 microlitri preriscaldati, mezzo McCoy's 5A a piena forza contenente herpes simplex virus one, codificando un rim mutante ICP6 a una molteplicità di infezione di cinque. Incubare le cellule con il virus per nove ore per indurre necroptosi. Come controllo positivo per l'induzione della necroptosi, stimolare le cellule per quattro ore con 200 microlitri di cocktail preriscaldato che induce necroptosi.
Come controllo negativo, aggiungere 22 microlitri di GSK840 micromolari preriscaldati a 37 gradi Celsius per inibire l'attività della chinasi RIPK3. Includere questo inibitore in una condizione non trattata e dopo la stimolazione necroptosi per prevenire l'autofosforilazione della serina 227. Per fissare le cellule, rimuovere il mezzo e lavare le celle con 200 microlitri di PBS.
Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 150 microlitri di paraformaldeide al 4% equilibrata a temperatura ambiente. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo la fissazione, rimuovere il 4% di paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS.
I campioni possono essere conservati in eccesso di PBS a quattro gradi Celsius durante la notte fino a ulteriore elaborazione. Rimuovere il PBS dalla piastra e incubare le cellule con 100 microlitri di tampone di permeazione a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di permeabilizzazione e lavare le cellule con 100 microlitri di tampone di lavaggio.
Incubare la camera di imaging con tampone di lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile. Per evitare il legame non specifico degli anticorpi primari, incubare la piastra con 100 microlitri di mezzo bloccante a temperatura ambiente per due ore su uno shaker da laboratorio inclinabile. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari alla camera di imaging. Assicurarsi di includere una condizione anticorpale non primaria per visualizzare il potenziale sfondo dell'amplificazione del segnale tyramide e impostare la soglia di mascheramento. Incubare la camera durante la notte a quattro gradi Celsius.
Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, incubare le cellule con 100 microlitri di anticorpo secondario marcato con HRP, riconoscendo la specie dell'anticorpo primario da amplificare per 30 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile. Durante l'incubazione degli anticorpi, preparare la miscela di tiramide biotinilata.
Per innescare l'attività enzimatica della HRP, aggiungere un substrato ossidante al tampone TSA appena prima dell'uso. Quindi diluire la tiramide biotinilata nel tampone TSA preparato utilizzando la diluizione ottimizzata. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari marcati con HRP, lavare i pozzetti tre volte con tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione su uno shaker da laboratorio inclinabile.
Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dal pozzetto, aggiungere biotina-tiramide diluita al pozzetto fino a un volume finale di 100 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile, seguito da tre lavaggi tampone di lavaggio. Preparare la miscela colorante contenente l'anticorpo secondario, la streptavidina accoppiata e la colorazione nucleare e il tampone di lavaggio.
Rimuovere il tampone di lavaggio e incubare la piastra con 100 microlitri di miscela colorante a temperatura ambiente per un'ora su uno shaker da laboratorio inclinabile. Tenere le camere di imaging al riparo dalla luce da questo passaggio in poi. Dopo la colorazione, lavare consecutivamente due volte con tampone di lavaggio e sciacquare i pozzetti due volte con PBS.
Conservare i campioni in eccesso di PBS a quattro gradi Celsius per preservare la colorazione fino all'imaging. La camera di imaging è ora pronta per essere visualizzata su un microscopio confocale. L'inclusione dell'amplificazione del segnale del tiramido ha permesso la robusta rilevazione di RIPK3 fosforilato alla serina 227 nel citosol del virus dell'herpes simplex uno che codifica per cellule infette da ICP6 mutante del rim.
Una potenza laser del 2% era sufficiente per il rilevamento sensibile. Nell'immunofluorescenza indiretta standard, una maggiore potenza laser è rimasta insufficiente per la rilevazione di phospho-RIPK3. Nella quantificazione delle immagini tridimensionali Z-stack, le cellule infette hanno mostrato un aumento di circa 20 volte dei voxel positivi per RIPK3 fosforilato rispetto alle cellule trattate con finzione.
L'aumento della colorazione fosfo-RIPK3 delle cellule infettate da herpes simplex virus wild-type one rispetto alle cellule trattate con simulazione ha indicato che il dominio rim di ICP6 non è in grado di bloccare completamente la fosforilazione di RIPK3 alla serina 227. GSK840 si lega al dominio chinasico di RIPK3 e previene la fosforilazione di RIPK3 alla serina 227 dopo l'attivazione di ZBP1, confermando la specificità del metodo di rilevazione fosfo-RIPK3 mediato dall'amplificazione del segnale della tiramide. Le cellule trattate con simulazione hanno mostrato una bassa colorazione citosolica leggermente punteggiata della fosforilazione di MLKL alla serina 358, mentre una forte colorazione è stata rilevata nel citosol, nel nucleo e nella membrana plasmatica delle cellule infette.
L'immunofluorescenza indiretta standard richiedeva una potenza laser del 40% per la rilevazione specifica di un segnale fosfo-MLKL nelle cellule infette. Al contrario, l'amplificazione del segnale tyramide ha aumentato la sensibilità di rilevamento del fosfo-MLKL, riducendo così la potenza laser necessaria al 6%La quantificazione dell'immagine Z-stack 3D ha mostrato un aumento di circa 90 volte del numero di voxel positivi per fosfo-MLKL utilizzando l'amplificazione del segnale tyramide, rispetto a un aumento di sette volte utilizzando il metodo standard, indicando una migliore soglia di rilevamento e sensibilità per phospho-MLKL. Simile al virus dell'herpes simplex, l'infezione da virus dell'influenza A ha innescato la necroptosi dipendente da ZBP1.
L'amplificazione del segnale Tyramide ha permesso la robusta rilevazione di phospho-RIPK3 e phospho-MLKL, indicando necroptosi. Per interpretare la colorazione confocale, è necessario includere diversi controlli di colorazione. Ciò comporta una condizione non primaria, singole macchie e un controllo positivo.
Adattando questo protocollo, è possibile amplificare più target utilizzando TSA sequenziale. Ciò consentirebbe la rilevazione di RIPK3 e MLKL fosforilati all'interno della stessa cella. Il rilevamento sensibile dei biomarcatori della necroptosi può essere utile per la ricerca ZBP1 in corso sull'autoinfiammazione o l'infezione virale in cui le vie di morte cellulare ZBP1-dipendenti eseguite devono ancora essere confermate come necroptosi, apoptosi o piroptosi.
